超高效液相色谱-串联质谱法测定酒类产品中13种添加剂

超高效液相色谱-串联质谱法测定酒类产品中13种添加剂
基金项目：“十三五”北海市海洋经济创新发展示范项目（项目编号：bhsfs009）。

收稿日期：2020-11-02；修回日期：2020-11-19
作者简介：陈高健（1986-），女，本科，主管药师，主要研究方向：食品、药品检验检测及方法开发研究。

通讯作者：汤丽昌（1986-），男，硕士，主管药师、高级技师，研究方向：食品中食品添加剂、兽药残留检验检测及方法开发研究。

DOI ：10.13746/j.njkj.2020236
陈高健，何锦锋，汤丽昌
（北海市食品药品检验所，广西北海536000）
摘
要：建立超高效液相色谱-串联质谱(ultra high performance liquid chromatography tandem mass
spectrometry,UPLC -MS/MS)同时测定酒类产品中13种食品添加剂含量的分析方法。

采用Agilent EC -C 18色谱柱（4.6mm×50mm,2.7μm ），柱温30℃，流动相由A （甲醇）和B （10mmol/L 甲酸和10mmol/L 甲酸铵溶液）组成，梯度洗脱，流速0.2mL/min 。

采用电喷雾负离子（ESI -）模式电离，多反应监测（multi-ple reaction monitoring ，MRM ）模式检测，外标法定量。

结果表明，在最佳条件下，13种食品添加剂可在10min 内有效分离,标准曲线线性关系良好（r ＞0.998）。

平均回收率为88.7%～107.1%，相对标准偏差为2.2%～8.7%，检出限为0.02～0.26mg/kg ，平均加样回收率89.9%～104.2%。

该方法快速、准确，灵敏度高，适用于酒类产品中甜味剂、防腐剂等13种食品添加剂的快速筛查和定量分析。

关键词：酒类产品；超高效液相色谱-串联质谱法；食品添加剂；甜味剂；防腐剂中图分类号：TS261.7；TS262
文献标识码：A
文章编号：1001-9286（2021）04-0116-06
Simultaneous Determination of 13Food Additives
in Alcoholic Drinks by UPLC-MS/MS
CHEN Gaojian,HE Jinfeng and TANG Lichang
(Beihai Institute for Food &Drug Control,Beihai,Guangxi 536000,China)
Abstract :In this study we established a method for the simultaneous determination of 13food additives in alcoholic drinks by UPLC-MS/MS.The chromatographic separations were obtained on an Agilent EC-C 18column (4.6mm×50mm,2.7μm)at 30℃.Gradient elution was carried out with methanol as phase A and 10mmol/L formic acid and 10mmol/L ammonium formate solution as phase B,and the flow rate was 0.2mL/min.Electrospray ionization in negative ion mode (ESI-)and multiple reactions monitoring (MRM)were adopted as the basis for quantitative analysis by external standard method.Under the optimal conditions,the 13food additives could be effectively separated within 10min.The standard curves had good linearity (r ＞0.998).The average recoveries were in the range of 88.7%to 107.1%,the relative standard deviations (RSDs)were 2.2%to 8.7%,the limits of detection (LODs)were 0.02mg/kg to 0.26mg/kg,and the average spiked recoveries were 89.9%to 104.2%.The method is rapid,accurate and sensitive,and is suitable for the rapid screening and quantitative analysis of the 13food additives in alcoholic drinks,including sweeteners and preservatives.
Key words :alcoholic drinks;UPLC-MS/MS;food additive;sweetener;preservative
食品添加剂是为改善食品品质和色、香、味，以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的
人工合成或者天然物质[1]。

食品添加剂的合理使用，不仅改善食品的风味和口感，同时也丰富食品
种类、延长了食品保存期。

但是食品添加剂超出限量控制、超出范围、违禁使用等现象使食品添加剂的安全问题又成为了食品安全方面的重大问题[2-3]。

食品添加剂本身没有太大营养价值，而且可能还具有一定的副作用[4]。

此外,有研究报道糖精钠、柠檬黄分别与苯甲酸钠联合作用于L-929细胞,可表现出毒性相加作用，食品添加剂的混合使用可能产生联合毒性作用[5]。

酒类产品作为节假日及婚丧喜庆必不可少的饮品，其饮用安全重要性不言而喻。

因此，笔者针对酒类产品中的甜味剂、防腐剂等食品添加剂进行了一种快速、准确、灵敏的分析方法研究。

目前，国家标准针对甜味剂和防腐剂等的检测主要以液相色谱法、气相色谱法为主要检测手段，而且各成分间执行检测方法标准又各不相同[6-11]。

从文献报道来看[12-18]，存在检测酒类产品单一（仅为白酒或葡萄酒）或所测成分仅为甜味剂，关于酒类防腐剂研究较少等问题。

本研究建立了一种高效液相色谱-串联质谱法同时检测酒类产品中13种食品添加剂的分析方法，其中，9种甜味剂分别是甜蜜素、三氯蔗糖、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜、赤鲜糖醇、糖精钠、甘草酸、山梨糖醇；3种防腐剂分别是山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸；以及作为酸度调节剂和防腐功能的柠檬酸。

该方法操作简便，结果准确，重复性好，可同时检测多种添加剂，满足高通量的检测要求，为酒类产品中添加剂检测提供快速有效的方法，为白酒中非法添加甜味剂等食品添加剂的快速筛查提供有力的技术支持。

1材料与方法
1.1材料、试剂及仪器
酒样：啤酒、葡萄酒、黄酒、配制酒、果酒、白酒样品，市售。

仪器设备：LC-MS/MS G6460高效液相色-串联质谱仪（美国Agilent公司，具体配置为1290超高效液相色谱仪，G6460三重串联四级杆质谱仪，Agilent Mass Hunter B.06.00工作站），XS205DU十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler公司），3-18KS高速台式冷冻离心机（德国SIGMA公司），5510E-DTH超声波清洗仪（上海必能信超声有限公司），Mili-Q超纯水仪（德国Merck公司）。

试剂及耗材：甘草酸、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、柠檬酸、糖精钠、山梨醇、甜蜜素、脱氢乙酸、安赛蜜、赤藓糖醇、苯甲酸、山梨酸对照品，分别购自德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司、中国食品药品检定所、上海安普生物科技有限公司（纯度≥98.0%；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），甲酸、乙酸铵（色谱纯，美国Tedia公司），亚铁氰化钾、乙酸锌（优级纯，天津市光复科技发展有限公司），水为Mili-Q 制备超纯水。

1.2实验方法
1.2.1对照品溶液制备
精密称取甘草酸、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、柠檬酸、糖精钠、山梨醇、甜蜜素、脱氢乙酸、安赛蜜、赤藓糖醇、苯甲酸、山梨酸对照品适量，加50%甲醇分别制成1mg/mL贮备液。

分别取各对照品溶液1mL，置于同一50mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得13种食品添加剂混合对照品溶液。

1.2.2供试品溶液
准确称取啤酒、葡萄酒、黄酒、配制酒、果酒2g 于50mL PE管中，加50%甲醇约25mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声50min，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液2mL和乙酸锌溶液2mL，混匀，置离心机中，以8000r/min离心5min，将上清液转移至50mL容量瓶中，于残渣中加50%甲醇20mL，涡旋混匀后超声5min，以8000r/min离心5min，将上清液转移到同一50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀，经0.22μm的微孔滤膜过滤[10]，取续滤液，即得。

准确称取白酒2g于蒸发皿中，于60℃恒温水浴锅加热蒸发至无醇味，冷却至室温后用水少量多次转移至50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，经
0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.2.3空白样品溶液
除不加试样外，按“1.2.2”项下方法同法制备空白样品溶液。

1.2.4仪器测试条件
色谱条件：Agilent EC-C18色谱柱（4.6mm×50mm,2.7μm）；流动相：水（A）-10mmol/L甲酸和10mmol/L甲酸铵水溶液（B），梯度洗脱（0～1min，5%→10%B；1～5min，10%→90%B；5～8min；90%B；8～10min，90%→5%B），流速为0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL。

质谱条件：采用电喷雾负离子源模式（Elec-tronic spray ion,ESI-），扫描方式为多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）；雾化气压力：30psi；干燥气温度：250℃；干燥气流速：8L/min；毛细管电压为3500V；MRM模式定量。

13种食品添加剂的电离方式、分子量、母离子、子离子、碎裂电压（Fragmentor）、碰撞能量（CE）等质谱参数见表1。

2结果与分析
2.1色谱条件优化
本试验考察了甲醇-10mmol甲酸水、甲醇-10mmol乙酸铵水、乙腈-10mmol甲酸水、甲醇-10mmol甲酸10mmol乙酸铵水溶液等流动相条件，发现以甲醇-10mmol甲酸10mmol乙酸铵水溶液作为流动相，优化梯度洗脱程序后各成分均可以达到较好的分离和峰形。

2.2质谱条件优化
通过对离子源模式（ESI）、碎裂电压（Fragmen-tor）、碰撞能量（CE）等条件进行优化，发现离子源在负离子模式（ESI mg/kg）优于负离子模式（ESI+），负离子模式（ESI mg/kg）下各成分均显示出较高的检测灵敏度。

优化所得13种成分UPLC mg/kg MS/MS色谱图结果见图1，由图1可知，13种活性成分分离良好无干扰，且峰形较好。

苯甲酸与山梨酸虽然只产生一个子离子，但可以从母离子、子离子以及合理的丰度比来确证及定量，故不影响检测要求。

2.3线性关系、定量限和检测限
按上文所建立的最佳实验色谱及质谱条件，精密量取对照品溶液适量，采用倍数稀释法，制得6个不同浓度梯度的混合系列溶液，分别进样测定3次，记录峰面积。

以对照品待测液浓度（x）为横坐标，峰面积平均值（y）为纵坐标，进行回归，得到13种成分的标准曲线线性回归方程、相关系数，再将混合对照品溶液逐步稀释，分别以信噪比S/N= 10、S/N=3时的质量浓度作为定量限和检测限，结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好（r＞0.998）。

由检出限和定量限结果可以看出，本方法灵敏度较高。

2.4加样回收率、精密度试验
本实验分别选取啤酒、葡萄酒、黄酒、配制酒、果酒（除柠檬酸外）及白酒阴性样品为样品，分别添加3个质量浓度水平的标样溶液，浓度梯度分别为：5mg/kg、25mg/kg、100mg/kg，按照以上最优实验方法，分别测定其含量，不同浓度水平样品进行6次重复实验，计算出加标回收率及精密度，结果
表113种待测食品添加剂质谱条件
序号1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13化合物名称
甘草酸
三氯蔗糖
纽甜
阿斯巴甜
柠檬酸
糖精钠
山梨醇
甜蜜素
脱氢乙酸
安赛蜜
赤鲜糖醇
苯甲酸
山梨酸
Mr
822.93
397.64
378.46
294.30
192.14
206.17
182.17
201.22
168.15
201.24
122.12
122.12
112.13
MS1(m/z)
821.3
394.8
377.0
293.0
190.9
181.8
180.9
177.9
166.9
161.8
120.9
120.9
110.9
MS2(m/z)
193.0
358.6
199.8
199.9
110.8
105.8
59.0
79.8
82.9
81.9
88.8
77.0
67.0
Fragmentor(V)
135
135
135
70
70
120
85
135
70
80
60
70
110
CE(eV)
45
5
10
5
5
15
15
25
10
10
5
5
45
见表3。

13种成分的回收率为88.7%～107.1%，表明该方法回收率良好。

RSD ：2.2%～8.3%，表明该方法精密度良好。

2.5
样品测定
按所建立的方法对5批次葡萄酒、5批次黄酒、5批次啤酒、5批次果酒、5批次配制酒及20批次白酒（包括十二大香型白酒）进行了13种食品添加剂的筛查，每个样品重复测定3
次。

所检葡萄
注：A.对照品；B.空白样品
图1多反应监测模式下13种成分UPLC -MS/MS 色谱图
表2
13种成分的回归方程、线性范围、相关系数、LOQ 和LOD
化合物名称甘草酸
三氯蔗糖纽甜阿斯巴甜柠檬酸糖精钠山梨醇甜蜜素脱氢乙酸安赛蜜赤鲜糖醇苯甲酸山梨酸
回归方程y =323.42x +73.33y =83.23x+24.62y =7992.23x -386.87y =4704.74x -1270.55y =79977.27x -27.95y =636.18x +956.15y =7198.70x +1143.68y =3425.67x +243.26y =5711.49x -1248.90y =9722.86x +956.85y =29.90x +10.21y =2399.66x +379.75y =438.17x -178.54
线性范围(mg/kg)
1～250
1～2501～2501～2501～2501～5001～2501～5001～2501～5001～2501～5001～500
r 0.99980.99820.99850.99930.99820.99910.99900.99980.99970.99900.99680.99950.9993
定量限(mg/kg)
0.690.730.100.170.100.070.430.130.100.070.860.070.10
检出限(mg/kg)
0.210.220.030.050.030.020.130.040.030.020.260.020.03
酒样品中有1批检出安赛蜜、甜蜜素和山梨酸，含量分别为33.82mg/kg、219.77mg/kg、132.13mg/kg；3批配制酒检出三氯蔗糖，含量分别为28.93mg/kg、88.26mg/kg、96.45mg/kg；1批白酒检出三氯蔗糖，
表3回收率及精密度测定结果(n=6)
化合物
名称甘草酸三氯蔗糖纽甜
阿斯巴甜柠檬酸糖精钠山梨醇甜蜜素脱氢乙酸安赛蜜赤鲜糖醇苯甲酸山梨酸加标浓度
(mg/kg)
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
5
25
100
啤酒
回收率
(%)
102.5
99.7
98.9
89.7
92.9
97.2
96.5
94.3
98.5
97.2
96.5
93.7
99.6
102.7
105.2
92.1
96.8
97.2
98.2
96.3
99.4
98.3
100.5
99.7
97.6
102.7
105.4
89.5
92.7
95.6
88.7
95.4
103.9
98.9
99.5
100.7
99.9
102.9
101.1
RSD
(%)
3.3
2.8
2.4
8.1
7.2
5.6
6.6
4.3
5.7
3.4
3.5
4.7
2.9
4.2
3.3
3.6
4.4
2.7
3.8
2.7
4.1
4.4
2.8
3.9
2.9
4.6
3.7
8.3
6.7
5.6
7.9
6.5
4.6
2.8
3.2
4.0
3.6
4.2
3.9
葡萄酒
回收率
(%)
98.3
102.5
97.3
92.5
97.6
96.3
97.3
94.8
90.5
99.6
97.5
97.4
103.2
102.3
104.4
99.5
103.4
104.4
103.4
105.2
96.6
97.9
96.2
98.9
103.7
100.4
98.9
92.5
99.7
101.3
92.5
96.3
97.5
100.2
102.5
99.6
101.9
99.3
98.7
RSD
(%)
4.5
2.8
3.3
6.9
5.2
7.6
4.4
5.2
6.1
5.5
4.9
3.1
5.1
3.6
4.5
4.7
5.6
3.3
6.2
3.7
5.5
3.5
2.8
7.0
5.1
3.9
2.8
6.6
7.2
4.3
6.6
5.7
3.9
5.0
3.9
3.7
4.4
2.9
4.3
黄酒
回收率
(%)
96.5
98.8
102.5
91.7
95.9
99.2
100.2
98.9
96.7
93.9
99.6
102.7
100.4
98.7
99.7
98.6
97.9
102.1
100.6
103.4
100.6
99.4
103.7
97.7
101.4
103.3
101.9
92.9
97.3
94.9
91.7
97.9
98.7
100.3
101.1
102.5
100.7
98.6
97.3
RSD
(%)
3.3
3.4
4.1
7.3
6.4
8.0
4.7
5.6
3.9
6.3
4.6
5.2
6.5
3.7
5.1
4.9
3.7
5.1
5.2
4.7
3.1
6.2
5.6
4.7
5.3
3.9
5.2
7.1
4.9
4.3
5.5
7.7
6.9
4.8
6.1
5.1
4.4
2.9
4.7
配制酒
回收率
(%)
103.3
99.5
97.7
98.7
96.9
94.7
103.5
101.2
97.9
90.4
99.5
100.5
97.2
101.5
107.1
97.8
98.4
101.7
100.4
98.8
97.2
98.8
96.3
95.5
99.8
101.9
103.5
97.1
96.2
94.5
97.1
96.5
92.1
97.3
102.4
103.7
102.4
100.6
103.7
RSD
(%)
3.7
3.0
3.4
6.5
7.9
8.4
5.1
4.7
6.1
5.1
4.6
3.7
6.2
3.7
4.2
5.3
6.2
3.6
6.4
5.1
3.4
4.2
3.5
5.1
6.1
3.9
4.1
7.6
4.2
5.7
5.7
8.1
7.2
5.3
4.6
5.6
4.5
3.3
3.9
果酒
回收率
(%)
102.5
100.3
100.9
93.7
96.8
106.9
104.7
100.8
101.7
100.3
98.7
97.6
98.9
96.4
97.5
96.9
99.7
98.6
97.5
95.3
93.7
102.3
99.1
98.3
100.2
99.9
100.3
98.9
94.3
97.5
91.7
96.7
99.6
99.4
100.3
102.5
103.1
101.2
98.5
RSD
(%)
4.3
2.8
3.1
5.6
4.9
7.8
7.1
5.1
6.3
4.5
5.1
4.2
5.1
3.8
3.3
6.3
3.7
4.5
4.7
5.1
6.6
6.1
3.7
5.1
4.9
3.4
5.2
6.7
5.2
7.3
6.9
5.7
5.2
3.7
5.2
3.1
3.5
4.1
5.2
白酒
回收率
(%)
101.3
102.7
100.8
89.9
97.7
103.4
99.7
103.9
102.5
100.3
99.7
99.3
97.5
101.5
103.2
100.7
102.9
101.1
90.9
97.7
96.5
101.7
97.1
99.6
96.7
101.1
102.7
89.5
92.7
95.6
92.7
99.3
95.9
99.3
103.9
101.5
102.4
100.3
99.2
RSD
(%)
2.2
2.5
2.9
7.8
5.2
6.5
4.2
3.5
2.9
5.2
4.9
5.3
4.9
6.1
3.9
5.1
3.9
2.9
5.3
7.1
6.9
3.3
3.6
5.1
6.4
3.7
2.5
5.1
4.9
6.8
6.2
5.2
7.4
3.9
6.2
5.7
4.5
5.5
5.7
含量为8.80mg/kg；1批配制酒检出柠檬酸，含量为15.02mg/kg；1批果酒检出苯甲酸，含量为123.10mg/kg；其余样品的检测结果均为阴性。

其中，两批配制酒标签分别显示配料表为：水、大米、糯米、蔗糖素，水、大米、清爽型干型清酒（水、糯米、蔗糖素），从配料表来看可以推测这两款酒是白酒生产工艺所得白酒外加三氯蔗糖，而标签显示执行配制酒标准，从检测结果判定来说，这两个产品是否能执行配制酒国家标准有待商榷。

另外1批检出三氯蔗糖的配制酒标签显示配料为：固液法白酒、多种药材、三氯蔗糖，标签标识符合配制酒要求[19]，其检出的三氯蔗糖含量也符合低于0.25g/kg限度要求[1]。

检出三氯蔗糖的1批白酒，其结果和本课题组成员采用国家标准检测方法所得结果一致[8]，白酒中不得添加任何非白酒发酵产生的呈香呈味物质，因此，判定为不符合国家标准规定。

检出柠檬酸的1批配制酒，标准显示柠檬酸出现可在各类食品中按生产需要适量使用的食品添加剂名单中[1]，可判定为符合规定。

啤酒、葡萄酒、黄酒、果酒中则均检出柠檬酸，含量在63.20～1221.23mg/kg之间，因柠檬酸为自身产生的风味物质，且可按生产需要适量使用，故不做判定。

3结论
经方法学考察验证，本试验建立了UPLC-MS/ MS法同时同时检测酒类产品中13种食品添加剂的分析方法。

与国家标准方法比较，该方法简便快速、专属性强、灵敏度高、快速且成本较低，符合相应的检测需求，其快速性可对各酒类样品进行快速筛查，较强的专属性可避免假阳性检测结果产生的误判，满足市场日常监管需求。

该方法为酒类产品的质量控制、安全评价提供科学依据，为保障日常酒类产品的饮用安全具有重要的意义。

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