siRNA讲座PPT
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100
80
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0
Activity of Randomly Selected siRNAs
14
SMARTselection TM 技术
100
Nature Biotechnology (2004) 22:326-330
Silencing efficiency
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
7
siRNA的结构
Sense strand
Anti-sense strand
Core region of the siRNA (19 nucleotides long) Overhang (2 nucleotides long)
8
RNAi 机制
mRNA
பைடு நூலகம்
mRNA
mR NA
9
RNAi 机制
RNAi过程借用了天然 的miRNA作用途径 siRNA miRNA 可以降解 mRNA或抑制mRNA 翻译成蛋白质 miRNA
•如何做到? • 如果RNA双链的末端 GC含量较高，则不利 于RISC解链。
•设计标准: • 反义链的5‘ 端多利用 A/U, 3' 端多利用G/C
28
链偏好性：利用链偏好性进行设计
Functional siRNAs and miRNAs Exhibit Strand Bias
• 防止正义链进入RISC，导致脱 靶效应的方法
191
201
211
221
231
241
251
261
271
281
大约 25% siRNA产生了 错误的表型推断
(导致细胞死亡功能表型)
Adapted from Fedorov et al., (2006) RNA, 12:1188
23
291
0
脱靶效应导致实验中的错误表型…
• 脱靶效应:
• 潜在的毒性 • 不一致的表型 (假阳性)
• 生物信息学： SMARTselection™ 设计技术 • 混合技术： SMARTpool™技术 • 化学修饰：ON-TARGETplus™ 化学修饰技术
12
序列设计：SMARTselectionTM技术
随机设计
传统设计
理性设计
随机选取 不考虑位点信息 脱靶效应严重
避开起始100bp AA（N19）TT GC含量 BLAST检索….
8 compound algorithm score
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 SMART score 8+++ parameter algorithm
我们应用更多的参数为您设计 高功能性的siRNA！
16
SMARTpool™ 技术
分析仪器设备 分析试剂耗材 软件 客户服务 等领域的领导者
150年历史 年销售额105亿美金 全球34,000员工 全球350,000客户 遍布150个国家
Biosciences Division
• Cell Culture
• Hyclone
• Genomics
• • • • • Dharmacon Abgene Open Biosystems Finnzymes Fermentas
• • • • miRNA 通过Seed region与 mRNA 3’UTR 相互作用 在反义链的 2-7 或 2-8 区 也称为六聚体或七聚体区 miRNA不需要与靶mRNA完全互补
Nature (2005) 433:769
target mRNA
5’ 3’ 3’ 5’
miRNA
seed region
内容
• 简介RNAi • Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品特性 • Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品简介
5
RNAi发展历史回顾
Plants: co-suppression 1990 Mammals: RNAi 2001
Napoli et al. 1990. Plant Cell 2:279
Silencing efficiency (median of 10)
8 parameter algorithm
Advanced SMARTselection™ design • Additional parameters • Target sequences avoided
• • • known SNPs highly redundant sequences highly homologous sequences
Fungi: quelling 1992
Elbashir et al. (2001) Nature 411:494 Romano (1992) Mol Micro 6:3343
Flies: RNAi 1998
Worms: RNAi 1998
Kennerdell et al. 1998. Cell 95:1017 Hammond et al. 2000. Nature 404:293 Zamore et al. 2000. Cell 101:25 Fire et al. (1998) Nature 391:806
提出siRNA设计经典的8大参数！
15
SMARTselection TM 技术
100 90
Silencing efficiency
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Published Algorithm • 8 Criteria important for Functionality • Demonstration of Rational Design Concept
19
siRNA 功能性 vs. 特异性
• 功能性和特异性是两个不同的方面:
• 功能性指的是一种siRNA沉默其靶基因的能力
如：1号siRNA将基因X的表达敲低了80% …
• 特异性指的是一种siRNA能够沉默多少种基因（非靶基因） 的表达
如： 1号siRNA沉默了基因X的表达，但是也同时将其它非靶 基因（ABCD)的表达沉默了…
6
RNAi 的发现
Nature (1998) 391:806
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
Andrew Z. Fire (StanfordU)
Craig C. Mello (UMass)
Adapted from Zamore (2002) Science, 296: 1265-1269.
25
增强特异性的策略
• 生物信息学: SMARTselection™ 设计技术
• 链偏好性 • Seed region区 过滤 • Seed 频率性分析
• 化学修饰: ON-TARGETplus™ 化学修饰技术 • 混合技术：SMARTpool ™技术
26
链偏好性 （Strand bias）
•siRNA 是对称的，RISC 对双链处理程序相同。
表型？？？
所有的siRNA均能够有效的敲低同一基因 表达（>80%）
24
必须增强siRNA特异性
•脱靶效应的危害性——阻碍siRNA应用的瓶颈
脱靶效应导致可以检测到的生物学效应，产生假阳性，干扰 实 验结果。严重的阻碍了siRNA在研究和治疗中的应用。
•降低脱靶效应——siRNA应用的重中之重
针对脱靶效应产生的原因，采用有效的技术手段，增强siRNA 的特异性，消除脱靶效应，在siRNA的应用中是至关重要的。
•如果反义链与 RISC结合:
因为反义链与靶mRNA是互 补的，所以会找到正确的靶基 因进行敲低。
•如果正义链与 RISC结合:
因为正义链同样有可能能够结 合某些mRNA（非靶mRNA） ，所以正义链结合后引起的基 因沉默导致了脱靶效应。
27
链偏好性: 定向的siRNA结合过程
Strand bias: 使 RISC只结 合siRNA的反义链。
20
Strictly Company Confidential
RNAi实验相关的特异性和非特异性效应
siRNA RNAi-related (off-targeting)
RNA
True gene knockdown signature
Unrelated to RNAi
Background
Lipid/siRNA Lipid
SMARTpool® Technology
针对同一mRNA的不同区域设计 4条不同的siRNA
17
SMARTpool™ 技术 : 保证siRNA的高功能性
AAAAA
18
Target mRNA
保证siRNA功能性
SMARTselectionTM
SMARTpool®
高功能的siRNA
ON-TARGETplusTM
8 parameter algorithm
8 compound algorithm score
与基因沉默效果相关的siRNA特性
• A bias towards low internal stability at the sense strand 3’-terminus • Lack of inverted repeats • Overall G/C content of siRNA molecule • Base preferences at specific positions
Khvorova A, et al. Cell (2003) 115: 209-216
SMARTselectionTM设计包括链 偏好性参数:
在保证功能性的前提下，是否能在 反义链的5 ‘端多利用A/U, 3’ 端多利 用G/C？
是: 好的设计 否: 采用 ON-TARGET® 修饰
29
生物信息学—Seed region
Thermo Scientific Dharmacon siRNA 产品特性
臧有霞 Helen Zang Bioscience Division Thermo Fisher Scientific
Thermo Fisher Scientific 公司简介
The world leader in serving science
脱靶效应导致实验中的错误表型…
• 分析了 300 随机设计的siRNA • 其靶基因均对细胞生存无影响
120
100
80
• 分析条件均为已达到最优化
60
40
结果：
• >25% 显示出对细胞生存的 “毒性”功能
20
1
11
21
31
41
51
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111
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151
161
171
181
• Proteomics
• Pierce • ABR antibodies
• Cellomics • Chemical
Dharmacon RNAi Technology
RNA合成的世界领先者 高效干扰siRNA的设计者 siRNA干扰的倡导者 RNAi基因组的发明者
与世界顶级研究机构的合作者 通过特定化学修饰提高干扰效率的革新者 最全面的生物信息学算法和最多干扰参数的拥有者 RNAi 技术领域专利技术和知识产权最大的持有者 应用Dharmacon技术在世界顶级杂志发表高水平文章最多的参与者
10
内容
• 简介RNAi • Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品特性
• 保证siRNA功能性的策略 • 保证siRNA特异性的策略
• Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品简介
11
Thermo Scientific Dharmacon 保证siRNA功能性的三大策略
SMARTselectionTM
大量序列 热动力学参数 生物信息分析
参数有限，大量筛选
独特的具有最小脱靶 效应的功能性siRNA
13
随机设计
only ~20% of randomly selected siRNAs knock-down target with efficiency 90% and higher
客户服务等领域的领导者biosciencesdivision?cellculture?hyclone?genomics?dharmacon?abgene?openbiosystems?finnzymes?fermentas?proteomics?pierce?abrantibodies?cellomics?chemicaldharmaconrnaitechnologyrna合成的世界领先者合成的世界领先者高效干扰顶级研究机构的合作者通过特定化学修饰提高干扰效率的革新者通过特定化学修饰提高干扰效率的革新者最全面的生物信息学算法和最多干扰参数的拥有者最全面的生物信息学算法和最多干扰参数的拥有者rnai技术领域专利技术和知识产权最大的持有者技术领域专利技术和知识产权最大的持有者应用dharmacon技术在世界顶级杂志发表高水平文章最多的参与者技术在世界顶级杂志发表高水平文章最多的参与者的设计者应用内容?简介rnai?thermoscientificdharmaconsirna产品特性?thermoscientificdharmaconsirna产品简介rnai发展历史回顾flies
5’-UTR
AUG
ORF
UAA
3’-UTR
AAAAAAAA
Lim LP et al.(2005) Nature 433:769
21
高功能性的siRNA并非都是特异的……
脱靶能力检测
功能性检测
RNA protein
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
功能性 ≠ 特异性
Adapted from Jackson et al., (2003) Nature Biotechnology, 21: 635-638. 22
Fraction MAPK14 remaining
100
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0
Activity of Randomly Selected siRNAs
14
SMARTselection TM 技术
100
Nature Biotechnology (2004) 22:326-330
Silencing efficiency
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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siRNA的结构
Sense strand
Anti-sense strand
Core region of the siRNA (19 nucleotides long) Overhang (2 nucleotides long)
8
RNAi 机制
mRNA
பைடு நூலகம்
mRNA
mR NA
9
RNAi 机制
RNAi过程借用了天然 的miRNA作用途径 siRNA miRNA 可以降解 mRNA或抑制mRNA 翻译成蛋白质 miRNA
•如何做到? • 如果RNA双链的末端 GC含量较高，则不利 于RISC解链。
•设计标准: • 反义链的5‘ 端多利用 A/U, 3' 端多利用G/C
28
链偏好性：利用链偏好性进行设计
Functional siRNAs and miRNAs Exhibit Strand Bias
• 防止正义链进入RISC，导致脱 靶效应的方法
191
201
211
221
231
241
251
261
271
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大约 25% siRNA产生了 错误的表型推断
(导致细胞死亡功能表型)
Adapted from Fedorov et al., (2006) RNA, 12:1188
23
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0
脱靶效应导致实验中的错误表型…
• 脱靶效应:
• 潜在的毒性 • 不一致的表型 (假阳性)
• 生物信息学： SMARTselection™ 设计技术 • 混合技术： SMARTpool™技术 • 化学修饰：ON-TARGETplus™ 化学修饰技术
12
序列设计：SMARTselectionTM技术
随机设计
传统设计
理性设计
随机选取 不考虑位点信息 脱靶效应严重
避开起始100bp AA（N19）TT GC含量 BLAST检索….
8 compound algorithm score
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 SMART score 8+++ parameter algorithm
我们应用更多的参数为您设计 高功能性的siRNA！
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SMARTpool™ 技术
分析仪器设备 分析试剂耗材 软件 客户服务 等领域的领导者
150年历史 年销售额105亿美金 全球34,000员工 全球350,000客户 遍布150个国家
Biosciences Division
• Cell Culture
• Hyclone
• Genomics
• • • • • Dharmacon Abgene Open Biosystems Finnzymes Fermentas
• • • • miRNA 通过Seed region与 mRNA 3’UTR 相互作用 在反义链的 2-7 或 2-8 区 也称为六聚体或七聚体区 miRNA不需要与靶mRNA完全互补
Nature (2005) 433:769
target mRNA
5’ 3’ 3’ 5’
miRNA
seed region
内容
• 简介RNAi • Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品特性 • Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品简介
5
RNAi发展历史回顾
Plants: co-suppression 1990 Mammals: RNAi 2001
Napoli et al. 1990. Plant Cell 2:279
Silencing efficiency (median of 10)
8 parameter algorithm
Advanced SMARTselection™ design • Additional parameters • Target sequences avoided
• • • known SNPs highly redundant sequences highly homologous sequences
Fungi: quelling 1992
Elbashir et al. (2001) Nature 411:494 Romano (1992) Mol Micro 6:3343
Flies: RNAi 1998
Worms: RNAi 1998
Kennerdell et al. 1998. Cell 95:1017 Hammond et al. 2000. Nature 404:293 Zamore et al. 2000. Cell 101:25 Fire et al. (1998) Nature 391:806
提出siRNA设计经典的8大参数！
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SMARTselection TM 技术
100 90
Silencing efficiency
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Published Algorithm • 8 Criteria important for Functionality • Demonstration of Rational Design Concept
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siRNA 功能性 vs. 特异性
• 功能性和特异性是两个不同的方面:
• 功能性指的是一种siRNA沉默其靶基因的能力
如：1号siRNA将基因X的表达敲低了80% …
• 特异性指的是一种siRNA能够沉默多少种基因（非靶基因） 的表达
如： 1号siRNA沉默了基因X的表达，但是也同时将其它非靶 基因（ABCD)的表达沉默了…
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RNAi 的发现
Nature (1998) 391:806
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
Andrew Z. Fire (StanfordU)
Craig C. Mello (UMass)
Adapted from Zamore (2002) Science, 296: 1265-1269.
25
增强特异性的策略
• 生物信息学: SMARTselection™ 设计技术
• 链偏好性 • Seed region区 过滤 • Seed 频率性分析
• 化学修饰: ON-TARGETplus™ 化学修饰技术 • 混合技术：SMARTpool ™技术
26
链偏好性 （Strand bias）
•siRNA 是对称的，RISC 对双链处理程序相同。
表型？？？
所有的siRNA均能够有效的敲低同一基因 表达（>80%）
24
必须增强siRNA特异性
•脱靶效应的危害性——阻碍siRNA应用的瓶颈
脱靶效应导致可以检测到的生物学效应，产生假阳性，干扰 实 验结果。严重的阻碍了siRNA在研究和治疗中的应用。
•降低脱靶效应——siRNA应用的重中之重
针对脱靶效应产生的原因，采用有效的技术手段，增强siRNA 的特异性，消除脱靶效应，在siRNA的应用中是至关重要的。
•如果反义链与 RISC结合:
因为反义链与靶mRNA是互 补的，所以会找到正确的靶基 因进行敲低。
•如果正义链与 RISC结合:
因为正义链同样有可能能够结 合某些mRNA（非靶mRNA） ，所以正义链结合后引起的基 因沉默导致了脱靶效应。
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链偏好性: 定向的siRNA结合过程
Strand bias: 使 RISC只结 合siRNA的反义链。
20
Strictly Company Confidential
RNAi实验相关的特异性和非特异性效应
siRNA RNAi-related (off-targeting)
RNA
True gene knockdown signature
Unrelated to RNAi
Background
Lipid/siRNA Lipid
SMARTpool® Technology
针对同一mRNA的不同区域设计 4条不同的siRNA
17
SMARTpool™ 技术 : 保证siRNA的高功能性
AAAAA
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Target mRNA
保证siRNA功能性
SMARTselectionTM
SMARTpool®
高功能的siRNA
ON-TARGETplusTM
8 parameter algorithm
8 compound algorithm score
与基因沉默效果相关的siRNA特性
• A bias towards low internal stability at the sense strand 3’-terminus • Lack of inverted repeats • Overall G/C content of siRNA molecule • Base preferences at specific positions
Khvorova A, et al. Cell (2003) 115: 209-216
SMARTselectionTM设计包括链 偏好性参数:
在保证功能性的前提下，是否能在 反义链的5 ‘端多利用A/U, 3’ 端多利 用G/C？
是: 好的设计 否: 采用 ON-TARGET® 修饰
29
生物信息学—Seed region
Thermo Scientific Dharmacon siRNA 产品特性
臧有霞 Helen Zang Bioscience Division Thermo Fisher Scientific
Thermo Fisher Scientific 公司简介
The world leader in serving science
脱靶效应导致实验中的错误表型…
• 分析了 300 随机设计的siRNA • 其靶基因均对细胞生存无影响
120
100
80
• 分析条件均为已达到最优化
60
40
结果：
• >25% 显示出对细胞生存的 “毒性”功能
20
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101
111
121
131
141
151
161
171
181
• Proteomics
• Pierce • ABR antibodies
• Cellomics • Chemical
Dharmacon RNAi Technology
RNA合成的世界领先者 高效干扰siRNA的设计者 siRNA干扰的倡导者 RNAi基因组的发明者
与世界顶级研究机构的合作者 通过特定化学修饰提高干扰效率的革新者 最全面的生物信息学算法和最多干扰参数的拥有者 RNAi 技术领域专利技术和知识产权最大的持有者 应用Dharmacon技术在世界顶级杂志发表高水平文章最多的参与者
10
内容
• 简介RNAi • Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品特性
• 保证siRNA功能性的策略 • 保证siRNA特异性的策略
• Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品简介
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Thermo Scientific Dharmacon 保证siRNA功能性的三大策略
SMARTselectionTM
大量序列 热动力学参数 生物信息分析
参数有限，大量筛选
独特的具有最小脱靶 效应的功能性siRNA
13
随机设计
only ~20% of randomly selected siRNAs knock-down target with efficiency 90% and higher
客户服务等领域的领导者biosciencesdivision?cellculture?hyclone?genomics?dharmacon?abgene?openbiosystems?finnzymes?fermentas?proteomics?pierce?abrantibodies?cellomics?chemicaldharmaconrnaitechnologyrna合成的世界领先者合成的世界领先者高效干扰顶级研究机构的合作者通过特定化学修饰提高干扰效率的革新者通过特定化学修饰提高干扰效率的革新者最全面的生物信息学算法和最多干扰参数的拥有者最全面的生物信息学算法和最多干扰参数的拥有者rnai技术领域专利技术和知识产权最大的持有者技术领域专利技术和知识产权最大的持有者应用dharmacon技术在世界顶级杂志发表高水平文章最多的参与者技术在世界顶级杂志发表高水平文章最多的参与者的设计者应用内容?简介rnai?thermoscientificdharmaconsirna产品特性?thermoscientificdharmaconsirna产品简介rnai发展历史回顾flies
5’-UTR
AUG
ORF
UAA
3’-UTR
AAAAAAAA
Lim LP et al.(2005) Nature 433:769
21
高功能性的siRNA并非都是特异的……
脱靶能力检测
功能性检测
RNA protein
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
功能性 ≠ 特异性
Adapted from Jackson et al., (2003) Nature Biotechnology, 21: 635-638. 22
Fraction MAPK14 remaining