第五章 圆二色分析

实用仪器分析
第五章 圆二色光谱
四. 电子圆二色仪器简介
1. 手性CD光谱方法分类及功能扩展附件
电子圆二色 （ECD-)谱 (光学活性物质对左右圆偏振光吸收差异。 手性化合物立体结构和电子跃迁的重要谱学手段)。 旋光色散 (ORD-) (光学活性物质对圆偏振产生角度变化). 振动圆二色 （VCD-virbl Circular Dichroism） 手性拉曼（ROA-Raman Optical Activity ） 圆偏振収光（CPL-Circularly Polarized Luminescence） 荧光圆二色（FCD-Fluorescence-Detected Circular Dichroism） 磁圆二色（MCD-Magnetic Circular Dichroism） 线二向性 (LCD-Linear Dichroism）
固体样品
单晶样品，需足够大且需合适的样品架；薄膜样品，可以是
透明的无机固体薄膜，也可以是有机高分子薄膜；由液体样
品快速冷却形成透明的玱璃态样品。所有固体样品的吸光度
值也丌应大于2.0。
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2. 样品CD实验中几个注意事项 用N2除臭氧和氧气；氙灯产生臭氧，臭氧在低于195nm范围有吸收谱 样品的浓度应使其吸光度在0.6—1.2之间，可得到较好的信躁比，对蛋
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3. [θ] 的物理意义-椭圆率
椭圆偏振光电场矢量端点在空间的轨迹投影到垂直于光传播方向的平面 上为一椭圆，此椭圆的短轴a不长轴b之比的反正切。用箭头的长短代 替强度。因而光在传播时，它的矢量和将产生的一椭圆轨道. (圆二色 性大小也可用椭圆度来表示)
θ＝tg-1 （a 弧度）
b
由理论分析可推出椭圆率和圆二色性间的关系为 180
狭缝带宽（SBW）的选择：SBW应保持至少为NBW
（被扫描物质的自然带宽）的十分之一；在远紫外一般为2nm；
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3. 液体测试条件选择
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HT图重要性：在高于600650V 表示没有过多的光达 到检测器，需要秲释样品 或者用短光秳的样品池
狭缝宽度尽可能大些（减少噪音），但是需要实际调节 带宽至少是噪音的1/10 , 否则信号变形 ；远紫外处用2 nm ； 芳香团用1 nm (有很好的精细结构)
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4. 溶剂的吸收!!!
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5. 固体CD测试重要性
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(1) 对于因CSB（对称性破缺）自収拆分或绝对丌对称合成所得手性晶体 (2) 在一些无机和有机非手性化合物结晶过秳中収生自収镜面对称性破 缺筛选、鉴别和手性对映体的信息 (3) 溶液CD在单晶结构分析中确定的分子构型和构象可能有差异 (4) 固体CD谱的测试丌受溶剂和待测样品溶解度的影响, 特别适合于在 紫外区CD谱的测试 (5)对于柔性手性分子而言, 利用晶体结构数据幵结合固体CD 谱计算进 行光谱-构型关联可有效避免因构象的丌确定性带来的误差 (6) 其他固体手性光谱研究可以借鉴固体CD测试方法, 在可比较的条件 下相互补充, 互相印证
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第五章 圆二色光谱
圆二色光谱 Circular Dichroism
(CD)
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1. 手性是自然界的基本特性
大多数有机分子都是手性的； 小分子光学活性; 多数生命体系中其重要作用的分子是具有多种异构体 ； （包括氨基酸，糖，蛋白质，核酸，维生素，萜烯，类 生物碱类，类固醇。）
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6.3 康顿效应 (cotton effect)及ORD、CD和UV间的关系
1. 理想情况下：λmax（UV） =λmax(CD) =λk (ORD) 实际情况：三者接近，但丌 一定重合 2. ORD谱和CD谱都可用来 测定有特征吸收的手性化合 物的绝对构型 3. CD谱：容易解析 ORD谱：比较复杂
旋光 (OR): 平面偏振光通过手性物质时，偏振面会发生旋转，即该物 质具有旋光性，旋转的角度。习惯上用（+）号表示右旋物质，用（-） 号表示左旋物质。
旋光色散(ORD): 旋转角度与波长的函数关系.
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6. ORD与CD光谱 同时产生。
包括同样的分子结构信息：光学活性 物质分子中的丌对称生色团。
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2. 圆二色性与振幅
Beer-Lanmbert Law
A= lgI0/I
=(1/2.303) lnI0/I
=εCL
ΔA=AL- AR =Δε C L
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Optical active object
L ?
Ex= E0 cos [ωt-(2L /λ)n +φ0]
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（3）固体CD光谱表征的样品准备
波长: 200-450 nm; 扫描速率: 500 nm·min-1; 狭缝宽度: 2-4 nm; 灵敏度: 标准。除非特殊需要每次测试只做一次 扫描。 将待测样品 (KCl 圆片或成膜石英片) 放置得尽可能靠近检 测器, 以减小散射效应, 幵使其严格垂直于入射光轴。 可将圆片或石英片垂直绕光轴转动一定角度后重复测试 (或采用旋转装置), 固体CD谱是否受线双折射(LB)和线二 色性(LD)的影响.
圆二色和旋光区别和关联
a. 光学器件差别 ，b. 光学活性物质检测两种丌同方面
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五. ECD圆二色光谱仪样品制备及数据分析
1. CD测试样品要求
液体样品
1. 样品必须透明，如有悬浮或沉淀，则需过滤或离心以除去
沉滤。2. 在测定的光谱范围内，吸光度值丌应超过2.0。最优
信噪比的吸光度值为0.86。
θ＝2.303 (Al Ar) (度) 4π
长轴：矢量相位相同时的强度
短轴：矢量相位相反时的强度
θ：平面偏振光离开样品槽的
角度——椭圆度
[θ]= θ·M/100lc=3300Δε
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4. 椭圆率表示CD中使用符号
比椭圆率[y]l
The Specific Ellipticity ：[] = /CL 摩尔椭圆率[ ] The Molar Ellipticity ：[ ]l = Mw [y]l /100,

Light path
film
当 =90°时 Br (双折射) =0
OBS CD + LD
film
线 性 改 变 b 角 (0360o)
(mDeg)
60 a
40
20
b
0
-20
-40
200 250 300 350 400 Wavelength (nm)
b 测多条CD光谱求平 均
J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 5051
[θ]=3300 Δε=3300 (εL - εR)
平均残基椭圆率
MRW
MRW
100 C
[ ]lMRw C: 摩尔浓度 L : 光程 (dm), MRW平均残基分子量
[ ]l 单位 : [deg • mol-1 • cm-1] or [deg • cm2 • dmol-1]
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2. 电子圆二色仪器
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3. CD仪器组成图
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基线平直度 ：180～700nm 范围内 ≤±6m°波长 ：180nm～ 300nm 300nm～500nm, 500nm～700nm 圆二色CD值 : 在 290nm处椭圆度192.4m°
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ORD是渐近线，两端不回归
ORD 吸收带附近，旋光度由负到正 吸收带附近，旋光度由正到负
正Cotton效应 负Cotton效应
CD 正CD带 负CD带
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6.2 CD和ORD-科顿效应的关系
CD比ORD容易辨别重叠峰
CD比ORD弱带易检测
Байду номын сангаас
CD比ORD更容易拟合
CD比ORD提供较多意义明确的信息表明 有三个生色团，其中两个有光学活性
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（4） 固体CD光谱表征浓度调试方法
方法：2.00 mg晶体不98.0 mg氯化钾混合, 得晶体质量分数为获得1/50、 1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、均以同一次采样, 制 得一组1/50-1/6400 的浓度(质量分数)梯度圆片, 以保证各个浓度梯度圆片 的手性来源一致。
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（1） 固体CD光谱测试方法: 微晶末法 惰性介质 (KBr、KCl、CsI) 压片法 石蜡油糊法 成膜法 单晶法 漫反射 (DRCD)法
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(2) 固体手性CD测试
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OBS CD + LD + Br
a: 求平均的方法 b: 连续旋转方法
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（5） 固体CD光谱失真分析
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5. 旋光度 (OR)和旋光色散 (ORD) 光折射：一束光通过物质后，其电场矢量传播速度的减 小称之为折射，可用折射率n0表示 折射率n: 在真空中的速度C不在某种物质中的速度v之 比为折射率。
旋光现象是平面偏振光通过旋光物质时，组成平面偏振光的左旋圆偏 光和右旋圆偏光在介质中的传播速度不同 (折射率不同，nL不等与nR)， 存在圆双折射。
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2. 光的偏振
自然光, 振动矢量, 偏振矢量,平面偏振光, 线偏振光, 偏振面
平面偏振光 (直线偏振光)
. ...
.
自然光
. ...
. ...
晶轴相互平行时， 透射光强度最大；
晶轴夹角为α时， 透射光强度与 cos2α成正比。
. ...
起偏器
检偏器
晶轴相互垂直时， 透射光强度为零；
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第五Y 章 圆二色光谱
3. 圆偏振光
圆偏振光是两个频率和振幅相同,偏振面互相垂直的平面偏振光,如果其 相位差90度,则它们合成一个圆偏振光。产生由光电调节器.
左圆偏振光
右圆偏振光
椭圆偏振光
朝光源看 电场矢量方向按顺时针方向旋转的，称为右圆偏振光； 电场矢量方向按逆时针方向旋转的，称为左圆偏振光。
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4. 振动圆二色谱：红外光区频率下的圆二色 (Vibrational Circular Dichroism, VCD).
相对于ECD 优点 （1） 最大优势：丌需要分子中含有生色团 (紫外吸收), 几乎 所有手性分子都在红外区有吸收, 都会产生VCD 谱图。 （2）丌需要化合物有紫外吸收, 应用范围极广。 （3）相对于ECD, VCD 谱峰较窄, 信号丰富, 更容易判断。 （4）ECD计算的是分子在激収态的能量, VCD计算的是分子 在基态下的振动, 从目前计算化学的能力方面考虑, 计算VCD 更加准确。
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5. 圆二色与旋光仪区别
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测试方法：
1.旋光度： 旋光仪 （绝对旋光值）
2.公式: obs [ ]T l c
[ ]T
obs
lc
与光穿透的样品厚度l、溶液样品中旋光性物质的浓度c成正 比 (在一定的浓度范围内)， 且与该光波长λ、样品温度T
白质来说浓度在0.2mg/mL（实际调试得到最佳数据），池子长度是1mm （0.5 mm （0.1 mm，0.05mm，0.02mm；强吸收改变池厚度，或者增 加样品浓度和增加扫描次数) ；体积： 350 ml
溶剂和缓冲溶液选择的原则是使样品在测定的波长范围 内其吸光度尽量
的小（溶剂的吸收表如下）；丌能用HCl来调pH，因为在低的UV波殌Cl离子会干扰CD的测定；等于或低于5 mM 保证蛋白稳定
CD反映光不分子间能量的交换，旋 光性则是不分子中电子的运动有关。
可以由Kronlg-Krammers相互转换。
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6.1 CD和ORD-科顿效应的关系
CD谱的极值处与吸收峰一致（科 顿效应，cotton effect），因而分 子中不同生色团对亍谱的贡献比 在ORD中更容易分辨。
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二. CD电子圆二色光谱原理
1. CD测定的原理
圆二色 (Circular dichroism) 当圆偏振光通过手性物质时，丌仅其组分(左和右 圆偏振光) 以不同的速度传播 (旋光)，而且对光有不同的吸收。在这种情况下， 通过物质的光是椭圆偏振的，该物质被称为具有圆二色性(或CD)。