HPLC分析方法的开发
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5.从定量限起做准确度，有回收率超标的风险
溶 液 稳 定 性
色 影谱 响条
件 的
耐用性
溶液配制
标准要求
需报告内容 溶液配制 色谱条件 标准要求 需报告内容
系统适应性溶液；标准品溶液；供试液
系统适应性溶液：如分离度符合要求
标准溶液：主峰峰面积与0 h相比应在0.9~1.1之间； 供试液：总杂含量与0 h相比应在 0.9~1.1之间； 各原单杂含量的极差≤0.05%；不得出现大于0.05% 的新杂质。 主峰面积变化可以增加，重点考虑杂质峰。
增敏溶液标准要求空白溶液在供试液和标准品溶液中主峰rt不干扰供试液和标准溶液已知单杂及主峰rt与相邻峰的r15供试液和标准溶液中主峰及已知杂质的rt保持一致供试液与标准品溶液中主峰的峰纯度因子990增敏溶液与系统适应性溶液中的已知杂质rt保持一致增敏溶液与供试液相比已知杂质rt处峰面积增强需报告内容分离度
实际测得值；理论值；单个回 收率，平均回收率
耐用性
溶液配制
标准要求
溶液稳定性 需报告内容
色谱条件的
溶液配制 色谱条件
影响
标准要求
需报告内容
系统适应性溶液；标准 品溶液；供试液
系统适应性溶液：如分离度符合要 求
标准品溶液及供试液：各时间点主 峰含量（或峰面积）与0h相比应在 98.0%~102.0% ； ； 主 峰 纯 度 因 子 ≥990。 系统适应性要求：主峰含量（或峰 面积）及峰纯度因子；各时间点含 量（或峰面积）与0 h的比值；符合 要求测试点的RSD。 系统适应性溶液；标准品溶液
系统适应性要求：主峰含量（或峰面积），RRT； 各时间点含量（或峰面积）与0 h的比值；单杂含量及 极差；总杂含量与0h的比值。
系统适应性溶液；标准品溶液（方法开发时应考虑 供试液）
流动相比例；流速；ph值；柱温；色谱柱批号。 同系统适应性项下
同系统适应性项下
溶液 灵敏度溶液 标准品溶液
供试液6份
进样针数 1或2针 1或2针
1针
1针 3、5、6针（根据
RSD定） 各1针
线性及范围
溶液配制 报告限~杂质限度的150%（至少5个点）
若方法描述中标准溶液的溶度超过了杂质限度， 则线性最高点做到对照液溶度的150%。
标准要求 r≥0.9990
Y轴截距/最低杂质限度时Y轴响应
须 报 告 主峰峰面积；6份含量单位，Mean±SD，
内容
RSD；95%CI（n=6）；含量均值的绝对差值
中间精密度：同一实验室内不同人、不同日期、不同仪器。 重现性：不同实验室之间。
重现性下进样序列
溶液名称 空白溶液
进样针数
1或2针
专属性溶液 1或2针
系统适应性溶液 1针
标准品溶液1 标准品溶液2
供试液6份 标准品溶液1
5或6针 2针
各1针 2针
目的
消除残留，排除 干扰，通常必需
若非综合验证， 不必需
看系统适应性项 目和要求
系统适应性
线性及范围
溶液配制 50%~150%的线性溶液（至少5个点）
标准要求 需报告内容
r≥0.9990 Y轴截距/100%浓度时Y轴响应值的绝对值≤2.0%
线性点的实际浓度及峰面积；线形图；线性范围；线性方程；相关 系数；残差平方和；Y轴截距；Y轴截距的95%CI；Y轴截距/100% 浓度时Y轴响应值的绝对值
标准要求 ATS与基地QC检测的已知杂质含量的绝对差值 ≤0.05%，总杂的绝对差值≤0.1%（可调整）
重现性中已经进行，此项不一定需要
主峰或已知单杂峰面积；6份及12份主峰或已知单杂含量单位， Mean±SD，RSD；95%CI（n=6）；含量均值的绝对差值
重现性下进样序列
溶液名称 空白溶液 专属性溶液 （如必要） 系统适应性
溶液配制 标准要求
系统适应性
空白溶液；标准品溶液；系统适应性溶 液
满足专论的系统适应性要求 对称因子应在0.8~1.5之间 RSD（见中国药典）
需报告内容
主峰与已知杂质RT；分离度；主峰 峰面积及RSD；拖尾因子或对称因 子或理论塔板数
系统适应性是分析方法达到分析目的的前提； 在分析方法验证前应进行系统性的测试，并在验证 过程中确保系统适应性符合要求。
检测限：S/N≥3； 定量限≥10； RSD（n=3）≤10.0%或15.0%； 定量限≤忽略限（报告限） 信噪比；主峰峰面积及RSD（RSD仅
是用于定量限）；定量限及检测限的浓
度及相当于供试液中主峰浓度的百分比。
准确度
溶液配制
标准要求 需报告内容
报告限，杂志限度，及线性最高点的准确度溶液各 3份，可用一个母液稀释。
液（6份）
标准要求
RSD（n=6）≤2.0%
溶液配制
同重复性
重现性 标准要求
RSD（n=6）≤2.0%
重复性与重现性均值的绝对值≤2.0%
溶液配制
ATS和基地对不同于验证使用的另一
样品检 测
标准要求
批次样品进行检测 ATS 与 基 地 QC 检 测 的 含 量 的 绝 对 差 值≤2.0%
重现性中已经进行，此项不一定需要
需报告内容 主峰与已知杂质RT，RRT；分离 度；主峰峰面积及RSD；拖尾因子 或对称因子或理论塔板数，主峰信 噪比。
专属性
溶液配制 空白溶液；标准品溶液；
供试液；
系统适应性溶液；增敏
空
溶液
白 干
标准要求
空白溶液在供试液和标准品溶液中主 峰RT不干扰
扰 及
供试液和标准溶液已知单杂及主峰RT 与相邻峰的R≥1.5
专属性
溶液配制 空白溶液；标准品溶液；供试液 Nhomakorabea标准要求
空白溶液在供试液和标准品溶液中主峰 RT不干扰 供试液中主峰RT与标准品溶液中主峰RT 保持一致
供试液与标准品溶液中主峰的峰纯度因 子≧99.5或符合色谱系统默认参数
需报告内容 主峰RT及主峰纯度因子
精密度
溶液配制
标准品溶液（2份）；供试
重复性
降解杂质。
精密度
重复性 重现性 样品检测 须报告内容
溶液配制 标准品溶液（1份）；供试液或100%加标 液或杂质限度浓度的主成分考察溶液（6份）
标准要求 RSD（n=6）≤10.0% 溶液配制 同重复性
标准要求 RSD（n=6）≤10.0% RSD（n=12）≤10.0%
重复性与重现性已知单杂含量均值（或主成分则 以主峰计）的绝对差值≤0.05%（可调整）。 溶液配制 ATS和基地对不同于验证使用的另一批次样品进 行检测
供试液和标准溶液中主峰及已知杂质
增
的RT保持一致
敏
供试液与标准品溶液中主峰的峰纯度
试 验
因子≧990 增敏溶液与系统适应性溶液中的已知
杂质RT保持一致
增敏溶液与供试液相比，已知杂质RT 处峰面积增强·
需报告内容 分离度；主峰及已知杂质峰RT及其峰 面积；主峰纯度因子。
专属性
溶液配制 未破坏供试液；各破坏试验空白溶液；
供试液，1份（供试品加标杂质）和/或 对照液，1份（主成分方法） 若成本太高，最低点可从50%做起，或用标准品代 替供试品。
单个回收率及平均回收率应在90%~110.0%； 回收率（n=9）的RSD≤10.0%。
实际测得值；理论值；单个回收率，平均回收 率及其95%置信区间及RSD。
1.杂质准确度测定通常采用回收率的方式检测，杂质标准品可得可行 2.对于原料药，杂质标准品不可得时不可行 3.对于制剂，杂质标准品不可得时可用主成分代替。 4.应考虑检测验证成本。不一定为做准确度而进行杂质标准品的制备 和标定。
线性和范围是两个不同的概念。应根据方法的特征首先确 定范围，然后在范围内验证方法的线性
Y轴截距的大小应根据范围的开始点设定，对于含量范围较 窄，且范围起始点离远点较远的方法，Y轴截距不必需或者 应放宽。
准确度
溶液配制 标准要求
需报告内容
80%，100%，120%的准确 度溶 液各2份
单个回收率及平均回收率应在 98%~102.0%； 回收率（n=9）的RSD≤2.0%。
流动相比例；流速；ph值；柱温； 色谱柱批号。 同系统适应性项下 同系统适应性项下
二、HPLC（有关物质或溶残）
系统适应性 专属性 精密度 线性及范围 准确度 定量限与检测限 耐用性
系统适应性
溶液配制 空白溶液；标准品溶液；系统适 应性溶液；灵敏度溶液
可接受标准 满足专论的系统适应性要求 对称因子应在0.8~1.5之间 RSD（见中国药典） S/N≥10
酸破坏试验；碱破坏试验；氧化破坏试验；
光照破坏试验，高温破坏试验
强 制
标准要求
各破坏溶液中新增降解杂质与主峰 及已知杂质R≥1.5（至少保留主峰与
降
相邻杂质的R的标准）
解
各破坏溶液中主峰的峰纯度因子
试
≥990
验 需报告内容 分离度；主峰纯度；主峰含量及降
解率；对比破坏前后各杂质变化情
况（RRT，含量及总杂）；列出主要
HPLC分析方法的开发
《药物研发技术》
HPLC方法
适用范围
方法学考察 系统适应性
专属性 精密度 线性及范围 准确度 定量限与检测
限 耐用性
HPLC
含量
有关物质或溶 残
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
一、HPLC（含量）
系统适应性 专属性 精密度 线性及范围 准确度 定量限与检测限 耐用性
值 的 绝 对 值 ≤5.0% （ 最 大 可 放 宽 至
10.0%）
需 报 告 内 线性点的实际浓度及峰面积；线形
容
图；线性范围；线性方程；相关系
数；残差平方和；Y轴截距；Y轴截
距的95%CI；Y轴截距/杂质限度对
应响应值的绝对值。
检测限及定量限
溶液配制 标准要求
需报告内容
标准溶液逐级稀释至S/N≥3和 S/N≥10时的浓度溶液，连续进样三针。
溶 液 稳 定 性
色 影谱 响条
件 的
耐用性
溶液配制
标准要求
需报告内容 溶液配制 色谱条件 标准要求 需报告内容
系统适应性溶液；标准品溶液；供试液
系统适应性溶液：如分离度符合要求
标准溶液：主峰峰面积与0 h相比应在0.9~1.1之间； 供试液：总杂含量与0 h相比应在 0.9~1.1之间； 各原单杂含量的极差≤0.05%；不得出现大于0.05% 的新杂质。 主峰面积变化可以增加，重点考虑杂质峰。
增敏溶液标准要求空白溶液在供试液和标准品溶液中主峰rt不干扰供试液和标准溶液已知单杂及主峰rt与相邻峰的r15供试液和标准溶液中主峰及已知杂质的rt保持一致供试液与标准品溶液中主峰的峰纯度因子990增敏溶液与系统适应性溶液中的已知杂质rt保持一致增敏溶液与供试液相比已知杂质rt处峰面积增强需报告内容分离度
实际测得值；理论值；单个回 收率，平均回收率
耐用性
溶液配制
标准要求
溶液稳定性 需报告内容
色谱条件的
溶液配制 色谱条件
影响
标准要求
需报告内容
系统适应性溶液；标准 品溶液；供试液
系统适应性溶液：如分离度符合要 求
标准品溶液及供试液：各时间点主 峰含量（或峰面积）与0h相比应在 98.0%~102.0% ； ； 主 峰 纯 度 因 子 ≥990。 系统适应性要求：主峰含量（或峰 面积）及峰纯度因子；各时间点含 量（或峰面积）与0 h的比值；符合 要求测试点的RSD。 系统适应性溶液；标准品溶液
系统适应性要求：主峰含量（或峰面积），RRT； 各时间点含量（或峰面积）与0 h的比值；单杂含量及 极差；总杂含量与0h的比值。
系统适应性溶液；标准品溶液（方法开发时应考虑 供试液）
流动相比例；流速；ph值；柱温；色谱柱批号。 同系统适应性项下
同系统适应性项下
溶液 灵敏度溶液 标准品溶液
供试液6份
进样针数 1或2针 1或2针
1针
1针 3、5、6针（根据
RSD定） 各1针
线性及范围
溶液配制 报告限~杂质限度的150%（至少5个点）
若方法描述中标准溶液的溶度超过了杂质限度， 则线性最高点做到对照液溶度的150%。
标准要求 r≥0.9990
Y轴截距/最低杂质限度时Y轴响应
须 报 告 主峰峰面积；6份含量单位，Mean±SD，
内容
RSD；95%CI（n=6）；含量均值的绝对差值
中间精密度：同一实验室内不同人、不同日期、不同仪器。 重现性：不同实验室之间。
重现性下进样序列
溶液名称 空白溶液
进样针数
1或2针
专属性溶液 1或2针
系统适应性溶液 1针
标准品溶液1 标准品溶液2
供试液6份 标准品溶液1
5或6针 2针
各1针 2针
目的
消除残留，排除 干扰，通常必需
若非综合验证， 不必需
看系统适应性项 目和要求
系统适应性
线性及范围
溶液配制 50%~150%的线性溶液（至少5个点）
标准要求 需报告内容
r≥0.9990 Y轴截距/100%浓度时Y轴响应值的绝对值≤2.0%
线性点的实际浓度及峰面积；线形图；线性范围；线性方程；相关 系数；残差平方和；Y轴截距；Y轴截距的95%CI；Y轴截距/100% 浓度时Y轴响应值的绝对值
标准要求 ATS与基地QC检测的已知杂质含量的绝对差值 ≤0.05%，总杂的绝对差值≤0.1%（可调整）
重现性中已经进行，此项不一定需要
主峰或已知单杂峰面积；6份及12份主峰或已知单杂含量单位， Mean±SD，RSD；95%CI（n=6）；含量均值的绝对差值
重现性下进样序列
溶液名称 空白溶液 专属性溶液 （如必要） 系统适应性
溶液配制 标准要求
系统适应性
空白溶液；标准品溶液；系统适应性溶 液
满足专论的系统适应性要求 对称因子应在0.8~1.5之间 RSD（见中国药典）
需报告内容
主峰与已知杂质RT；分离度；主峰 峰面积及RSD；拖尾因子或对称因 子或理论塔板数
系统适应性是分析方法达到分析目的的前提； 在分析方法验证前应进行系统性的测试，并在验证 过程中确保系统适应性符合要求。
检测限：S/N≥3； 定量限≥10； RSD（n=3）≤10.0%或15.0%； 定量限≤忽略限（报告限） 信噪比；主峰峰面积及RSD（RSD仅
是用于定量限）；定量限及检测限的浓
度及相当于供试液中主峰浓度的百分比。
准确度
溶液配制
标准要求 需报告内容
报告限，杂志限度，及线性最高点的准确度溶液各 3份，可用一个母液稀释。
液（6份）
标准要求
RSD（n=6）≤2.0%
溶液配制
同重复性
重现性 标准要求
RSD（n=6）≤2.0%
重复性与重现性均值的绝对值≤2.0%
溶液配制
ATS和基地对不同于验证使用的另一
样品检 测
标准要求
批次样品进行检测 ATS 与 基 地 QC 检 测 的 含 量 的 绝 对 差 值≤2.0%
重现性中已经进行，此项不一定需要
需报告内容 主峰与已知杂质RT，RRT；分离 度；主峰峰面积及RSD；拖尾因子 或对称因子或理论塔板数，主峰信 噪比。
专属性
溶液配制 空白溶液；标准品溶液；
供试液；
系统适应性溶液；增敏
空
溶液
白 干
标准要求
空白溶液在供试液和标准品溶液中主 峰RT不干扰
扰 及
供试液和标准溶液已知单杂及主峰RT 与相邻峰的R≥1.5
专属性
溶液配制 空白溶液；标准品溶液；供试液 Nhomakorabea标准要求
空白溶液在供试液和标准品溶液中主峰 RT不干扰 供试液中主峰RT与标准品溶液中主峰RT 保持一致
供试液与标准品溶液中主峰的峰纯度因 子≧99.5或符合色谱系统默认参数
需报告内容 主峰RT及主峰纯度因子
精密度
溶液配制
标准品溶液（2份）；供试
重复性
降解杂质。
精密度
重复性 重现性 样品检测 须报告内容
溶液配制 标准品溶液（1份）；供试液或100%加标 液或杂质限度浓度的主成分考察溶液（6份）
标准要求 RSD（n=6）≤10.0% 溶液配制 同重复性
标准要求 RSD（n=6）≤10.0% RSD（n=12）≤10.0%
重复性与重现性已知单杂含量均值（或主成分则 以主峰计）的绝对差值≤0.05%（可调整）。 溶液配制 ATS和基地对不同于验证使用的另一批次样品进 行检测
供试液和标准溶液中主峰及已知杂质
增
的RT保持一致
敏
供试液与标准品溶液中主峰的峰纯度
试 验
因子≧990 增敏溶液与系统适应性溶液中的已知
杂质RT保持一致
增敏溶液与供试液相比，已知杂质RT 处峰面积增强·
需报告内容 分离度；主峰及已知杂质峰RT及其峰 面积；主峰纯度因子。
专属性
溶液配制 未破坏供试液；各破坏试验空白溶液；
供试液，1份（供试品加标杂质）和/或 对照液，1份（主成分方法） 若成本太高，最低点可从50%做起，或用标准品代 替供试品。
单个回收率及平均回收率应在90%~110.0%； 回收率（n=9）的RSD≤10.0%。
实际测得值；理论值；单个回收率，平均回收 率及其95%置信区间及RSD。
1.杂质准确度测定通常采用回收率的方式检测，杂质标准品可得可行 2.对于原料药，杂质标准品不可得时不可行 3.对于制剂，杂质标准品不可得时可用主成分代替。 4.应考虑检测验证成本。不一定为做准确度而进行杂质标准品的制备 和标定。
线性和范围是两个不同的概念。应根据方法的特征首先确 定范围，然后在范围内验证方法的线性
Y轴截距的大小应根据范围的开始点设定，对于含量范围较 窄，且范围起始点离远点较远的方法，Y轴截距不必需或者 应放宽。
准确度
溶液配制 标准要求
需报告内容
80%，100%，120%的准确 度溶 液各2份
单个回收率及平均回收率应在 98%~102.0%； 回收率（n=9）的RSD≤2.0%。
流动相比例；流速；ph值；柱温； 色谱柱批号。 同系统适应性项下 同系统适应性项下
二、HPLC（有关物质或溶残）
系统适应性 专属性 精密度 线性及范围 准确度 定量限与检测限 耐用性
系统适应性
溶液配制 空白溶液；标准品溶液；系统适 应性溶液；灵敏度溶液
可接受标准 满足专论的系统适应性要求 对称因子应在0.8~1.5之间 RSD（见中国药典） S/N≥10
酸破坏试验；碱破坏试验；氧化破坏试验；
光照破坏试验，高温破坏试验
强 制
标准要求
各破坏溶液中新增降解杂质与主峰 及已知杂质R≥1.5（至少保留主峰与
降
相邻杂质的R的标准）
解
各破坏溶液中主峰的峰纯度因子
试
≥990
验 需报告内容 分离度；主峰纯度；主峰含量及降
解率；对比破坏前后各杂质变化情
况（RRT，含量及总杂）；列出主要
HPLC分析方法的开发
《药物研发技术》
HPLC方法
适用范围
方法学考察 系统适应性
专属性 精密度 线性及范围 准确度 定量限与检测
限 耐用性
HPLC
含量
有关物质或溶 残
√
√
√
√
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一、HPLC（含量）
系统适应性 专属性 精密度 线性及范围 准确度 定量限与检测限 耐用性
值 的 绝 对 值 ≤5.0% （ 最 大 可 放 宽 至
10.0%）
需 报 告 内 线性点的实际浓度及峰面积；线形
容
图；线性范围；线性方程；相关系
数；残差平方和；Y轴截距；Y轴截
距的95%CI；Y轴截距/杂质限度对
应响应值的绝对值。
检测限及定量限
溶液配制 标准要求
需报告内容
标准溶液逐级稀释至S/N≥3和 S/N≥10时的浓度溶液，连续进样三针。