碱提法提取燕麦麸皮蛋白工艺条件的优化

第26卷第4期2008年7月
北京工商大学学报(自然科学版)
Journal of Beiji ng Technology and Business University(Natural S cience Edition)
V ol 26N o 4Jul.2008
文章编号:1671 1513(2008)04 0009
04碱提法提取燕麦麸皮蛋白工艺条件的优化
韩 扬, 王昌涛, 董银卯, 李坤远
(北京工商大学北京市植物资源研究开发重点实验室,北京 100037)
摘 要:以燕麦麸皮为原料,通过碱提工艺提取燕麦麸皮蛋白,并优化了实验室提取条件.在碱法水解蛋白工艺中,以水解温度、时间、加碱量为单因素考察,并运用甲醛滴定法对燕麦蛋白的水解度
进行测定.结果表明:料液比为1 20,反应时间为2h,溶液含碱量为1 0mol/L 时为最佳提取工艺,该工艺的水解度大约为30%左右;通过凝胶色谱分析了水解物的分子量变化情况,在最佳生产工艺条件下,水解产物主要是对应的相对分子质量为31500u 和100~200u 的物质.关键词:燕麦麸;燕麦麸蛋白;碱法水解
中图分类号:TS201 2+
1 文献标识码:A 收稿日期:2007 09 21
作者简介:韩 扬(1985 ),男,北京人,硕士研究生,研究方向为生物加工工艺;
董银卯(1963 ),男,河北辛集人,教授,主要从事生物加工工艺方面的研究.通讯作者.
植物水解蛋白质含有人体所需要的氨基酸等多种营养成分[1].燕麦麸是燕麦加工过程中的副产物,含有大量的蛋白质和膳食纤维[2].目前国内外对燕麦麸的研究主要集中在膳食纤维上,而有关燕麦麸蛋白的研究很少[3 4]
.本实验采用燕麦麸为原料提取了燕麦麸分离蛋白,并利用碱法水解对其进行改性,考察了不同水解度对蛋白质分子结构及功能性质的影响,拟为燕麦蛋白的更好利用提供一些理论依据
[5 6]
.
1 实验材料与方法
1 1 原料
燕麦麸皮,张家口面粉厂提供.
1 2 仪器
DSHZ 300型多用途水浴恒温振荡器,江苏太仓实验设备厂;T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司.1 3 实验方法
1 3 1 燕麦蛋白水解液中成分分析
蛋白质水解度的测定:甲醛滴定法[7].
所谓蛋白质的水解度(degree of hy drolysis,DH )是指蛋白质中的肽键被水解的百分数,其计算公式为:
DH%=h/h tot !100%.
其中,h 是蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔(mmol/g 蛋白质),而h tot 则是指每克原料蛋白中肽键的毫摩尔.对于某一特定的蛋白质,该值是一个常数,但由于蛋白质中的肽键的数目没法精确地测出,而且不同的蛋白质其肽键的含量也不同,因此,一般根据文献取一个经验值.1 3 2 碱提法制备燕麦蛋白水解液
在料水比为1 20时,即称取20~60目过筛的燕麦麸皮5g ,量取100mL 蒸馏水,加入500mL 的圆底烧瓶中.后加入0 05mL 葡聚糖酶在60∀水浴中充分反应30m in,再加入1mL 高温 淀粉酶,在80∀下反应30m in,取出几滴水解液用碘液检测,直至溶液不显示蓝色,表明淀粉已除净.接着按溶液中碱含量为1mol/L 加入4g NaOH 固体,用玻璃棒充分搅拌后再在80∀水浴下继续反应2h,随后在10000r/min 条件下离心20min,收集上清液即为燕麦蛋白水解液.
1 3 3 燕麦麸皮水解蛋白提取工艺参数单因素试
验方法
1)水解时间对水解蛋白质工艺的影响
以蛋白质水解度为指标,设定水解时间分别为0 5,1 5,2 0,3 0,5 0h,同时将料液比和温度分别
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控制在1 20和80∀,按溶液中碱含量为1mol/L 的条件进行水解反应,后在10000r/m in 的条件下离心20m in,取上清液测水解度.
2)水解温度对水解蛋白工艺的影响
以水解度为指标,设定水浴温度分别为60,70,80,90,100∀,同时控制料液比为1 20,溶液中碱含量为1mol/L 的条件进行反应,水浴反应2h 后在10000r/m in 的条件下离心20m in,取上清液测水解度.
3)加碱量对水解蛋白工艺的影响
以水解度为指标,按溶液中NaOH 浓度分别为0 5,1 0,3 0,4 0,5 0mol/L,同时料液比控制在1 20和80∀,水浴反应2h 后在10000r/min 的条件下离心20min,取上清液测水解度.
1 3 4 凝胶层析色谱法分析蛋白水解液分子量分
布状况1)柱条件
色谱柱 1 5!60cm;凝胶:Sephadex G 25Fine;上样量 5mL;上样流速:0 8m L/m in;定时收集:5min/管.
2)操作方法
制作标准曲线,然后将燕麦水解液进行凝胶层析,制作洗脱体积-蛋白吸光度值曲线,用紫外分光光度计逐管测定其吸光度A 280,并确定各水解液的洗脱峰最高点,然后量出其洗脱体积.
2 结果与分析
2 1 碱法水解燕麦蛋白单因素试验结果2 1 1 水解时间对碱法水解的影响
按1 3 31)中内容进行试验,进而检测水解度变化情况,结果如图
1.
图1 水解时间对碱解蛋白水解率的影响
由图1可知,随着时间的延长水解度不断升高,
而且在1~3h 间水解度增加的趋势较快,3~4h 水解度增加十分缓慢.可能是由于反应温度和碱液浓度的限制,当反应3h 时已经达到很高的程度,而这时即使水解时间增加,水解效果也不再明显升高了.而从生产效率考虑,当水解度达到一定程度时,即可终止反应.试验中当水解时间为2h 时,水解度已达到34 59%,因此确定水解时间为2h.2 1 2 水解反应温度对碱法水解的影响
按1 3 32)中内容进行试验,进而检测水解度变化情况,结果如图2.
图2 水解温度对碱解蛋白水解率的影响
由图2可知,随着温度的升高,水解度呈上升趋势.可见,提高温度对水解的影响较明显.在加碱量同样的条件下,可以通过提高温度和延长水解时间来提高水解度.而温度过高,不利于生产中过程控制,而当温度达到80∀时,水解度已达到34 48%,因此,将试验中反应温度定为80∀.2 1 3 水解液中加碱量对碱法水解的影响按1 3 33)中内容进行试验,检测水解度变化情况,结果如图3.
图3 碱浓度对碱解蛋白水解率的影响
由图3可知,在本试验设定的范围内,氢氧化钠
浓度越高,则水解度越大.但水解度的升高与碱液浓度的增加不成倍数关系,在碱液浓度为0 5~1 0
10北京工商大学学报(自然科学版) 2008年7月
mol/L,3 0~4 0mol/L 范围增加较快,1 0~3 0mol/L 范围直线较平缓,也就是说浓度的增加对水解度的升高效果不十分明显.生产中,碱浓度的增加会使生产设备的损耗加剧,要适当控制碱浓度.试验中,当NaOH 浓度为1 0mol/L 时,水解度达到32 33%,因此选取NaOH 浓度为1 0mol/L.2 1 4 试验条件的选择
根据单因素试验结果,可以确定制备燕麦蛋白水解液的工艺路线:1)料液比:1 20;2)水解时间:2h;3)水解温度:80∀;4)水解液中NaOH 含量:1 0mol/L.
由于燕麦中含有大量的 葡聚糖,而根据其物理性质,大量的 葡聚糖存在会使水解液黏度增加,因此加入一定量 葡聚糖酶,水解 葡聚糖.另外,燕麦中含有大量的淀粉而影响水解液口感,于是在水解液中加入一定量高温 淀粉酶.
按以上生产工艺,最终燕麦蛋白水解液中蛋白质水解度达到30%.
2 2 燕麦水解物分子量的测定结果
2 2 1 燕麦水解物的紫外扫描结果
将燕麦的水解产物用紫外可见分光光度计进行波长扫描,结果见图
4.
图4 燕麦水解产物的紫外扫描结果
由图4可知,燕麦的水解物在紫外区有明显的吸收,特别是在230nm 和280nm 处,有两个吸收高峰出现,虽然230nm 下的紫外吸收峰更高,但从文献知,在280nm 下测得的蛋白含量已经很准确.所以,本试验中用凝胶色谱法测燕麦肽的相对分子质量时,通过测定所收集组分的280nm 处的吸光度值,作出洗脱图谱,便能达到精确的结果.2 2 2 标准曲线的制定
将已知相对分子质量的标准品物质牛血清白蛋白、牛胰岛素、氧化型谷胱甘肽、及维生素B 12分别配成1%的溶液,经微孔滤膜过滤后分别进样3mL.
以相对分子质量的对数为纵坐标,洗脱体积为横坐标,做出标准曲线如图
5.
图5 相对分子质量的对数与洗脱体积的关系
由图5可知,采用最小二乘法,求出直线的回归方程为:Y =-0 0298X +7 1547,其回归系数R 2=0 999,式中X 代表洗脱体积,Y 代表相对分子质量对数.采用该回归方程可以根据某物质的洗脱体积估算出该物质的相对分子质量.
2 2
3 碱法水解燕麦麸皮蛋白水解物的凝胶层析
结果
图6代表碱解蛋白作用不同时间后,水解产物经Sephadex G 25型凝胶柱层析所得到的洗脱体积情况
.
图6 0 5,2 0,4 0h 蛋白水解物相对分子质量情况
由图6可以看出,多肽分子是连续分布的,即水解物存在着各种相对分子质量大小不等的肽分子.水解物中多肽主要分布在洗脱体积在100~250mL 之间.3个不同水解时间的产物均有两个较为明显的吸收高峰.此外,更加明显的现象是随着时间的进行,第一个峰值逐渐减小而第二个峰值逐渐增加,说明前一峰相对分子质量所对应的物质逐渐水解成后一峰所对应的物质,并且在这一过程中伴随着后峰前后小的相对分子质量物质的生成.当水解时间为2h 时,洗脱峰有两个最高点出现在洗脱体积分别为90m L 和190mL,此时由标准曲线可知相对分子质量分别在31500u 和100~200u 左右.
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第26卷第4期 韩 扬等:碱提法提取燕麦麸皮蛋白工艺条件的优化
3 结 论
通过对燕麦麸皮中蛋白提取及水解工艺进行的研究,可以得出:
1)实验中发现,碱提法因为在高碱条件下作用,会产生游离的单宁、釉质等物质,而这些物质在水解液中会发生褐变,生成有色物质,并附着于蛋白质分子上,使蛋白质颜色加深,并使燕麦蛋白水解液最终呈现为黄褐色,而这种颜色不利于感官评价.因此,在实际生产中为改善蛋白质色泽,提高其品质,应对其进行脱色.
2)碱法水解蛋白的水解度在30%左右.水解产物主要是对应相对分子质量分别在31500u和100~200u左右的小分子物质.
3)由于是在碱性极强条件下水解蛋白,使得水解液的风味不佳需要脱碱,调至中性后稍有改善.参考文献:
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OPTIMIZATION OF PROCESS CONDITIONS OF
EXTRACTING PROTEIN FROM OAT BRAN
HAN Yang, WANG Chang tao, DONG Yin mao, LI Kun yuan (Beij ing K ey L aboratory o f Plant Resour ces Resear ch and Develop m ent,Beij ing Technology and
Business Univer sity,Beij ing100037,China)
Abstract:The experiment is done to research on abstracting protein from oat bran through the alkali dissolution acid deposition method and optim izes the craft.In the craft of the alkali hydrolysis protein from oat bran,the single factor is the temperature,time and the concentration of alkali.The solution degree of protein is measured by form aldehyde method.T he result show s the optimum of the craft is1 20(m/w),the time of the hydrolysis is2hours and the concentration of alkali is1mol/L.The solution degree of protein is30%.T he molecular of the solute are both in31500u and100~200u is measured by Sephadex G 25Fine.
Key words:oat bran;protein of oat bran;alkali hydrolysis
(责任编辑:叶红波)
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