小反刍兽疫病毒样颗粒的构建及定量分析

中国兽医科学２０１４，４４（１０）：９９７－１００２ＣｈｉｎｅｓｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅ
中图分类号：Ｓ８５２．６５９．５文献标志码：Ａ文章编号：１６７３－４６９６（２０１４）１０－０９９７－０６
小反刍兽疫病毒样颗粒的构建及定量分析
邓俊花，林祥梅，张永宁，王彩霞，吴绍强＊
（中国检验检疫科学研究院，北京１０００２９）
摘要：为研制一种无生物传染性且极易保存稳定的小反刍兽疫病毒（ＰＰＲＶ）ＲＮＡ阳性质控品，以ｐＴｒｃＨｉｓ－ＭＳ２质粒为模板，借助点突变技术在噬菌体ＭＳ２编码的外壳蛋白第１５位与第１６位氨基酸基因之间插入组氨酸蛋白标签的相应序列，构建了ｐＴｒｃＭＳ载体。

将ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｎ３８２质粒与ｐＴｒｃＭＳ质粒分别进
行Ｋｐｎ：＋Ｈｉｎｄ＜双酶切、连接从而构建了ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ重组质粒。

将ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ重组菌进行原核
表达，借助偶联组氨酸蛋白标签的磁珠捕获技术获得纯化的小反刍兽疫病毒样颗粒，对它进行特性鉴定并定量检测。

结果显示，ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样物质纯度高；电镜下为不规则的、直径约为２６ｎｍ的多边形；耐ＲＮＡ酶Ａ，稳定；经荧光ＲＴ－ＰＣＲ定量检测，此病毒样物质的溶液浓度相当于１０８．５６ＰＦＵ／ｍＬ。

本研究将为小反刍兽疫病毒分子生物学的检测提供阳性质控物质。

关键词：小反刍兽疫；病毒样颗粒；组氨酸蛋白标签；纯化；定量分析
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｅｓｔｅｄｅｓｐｅｔｉｔｓｒ
ｕｍｉｎａｎｔｓｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ
ＤＥＮＧＪｕｎ－ｈｕａ，ＬＩＮＸｉａｎｇ－ｍｅｉ，ＺＨＡＮＧＹｏｎｇ－ｎｉｎｇ，ＷＡＮＧＣａｉ－ｘｉａ，ＷＵＳｈａｏ－ｑｉａｎｇ
（ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄＱｕａｒａｎｔｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎｕｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｄｓｔｅａｄｙｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｅｓｔｅｄｅｓｐｅｔｉｔｓｒｕｍｉｎａｎｔｓｖｉｒｕｓ（ＰＰＲＶ）ＲＮＡｉｓｖｉｔａｌ．ｐＴｒｃＭＳｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｏｆｗｈｉｃｈｐＴｒｃＨｉｓ－ＭＳ２ｐｌａｓｍｉｄｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ６Ｈｉｓ－ｔａｇｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｄｏｎｓ１５ａｎｄ１６ｏｆＭＳ２ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｕｓｉｎｇａｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄ．ｐＧＥＭ－Ｔ－
Ｎ３８２ｐｌａｓｍｉｄｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＫｐｎ：＋Ｈｉｎｄ＜ａｎｄｌｉｇａｔｅｄｉｎｔｏＫｐｎ：＋Ｈｉｎｄ＜ｓｉｔｅｓｉｎｐＴｒｃＭＳ，ｃｒｅａ－ｔｉｎｇｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ．ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈ０．５ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，ｔｈｅｎｔｈｅＡｒｍｏｒｄ－ＲＮＡ（ＡＲ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｃａｐｔｕｒｅｄｗｉｔｈＭａｇｎｅＨｉｓＮｉ－Ｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｒｏｍｂａｃ－
ｔｅｒｉａｌｌｙｓａｔｅｓ，ａｎｄｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅＨｉｓ－ｔａｇｇｅｄＡＲｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｐｕｒｅ．ＡＴＥＭｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＡＲｐａｒｔｉｃｌｅｓｈａｄｔｈｅｓｈａｐｅｏｆａｒｏｕｎｄｐａｒｔｉｃｌｅｔｈａｔｗａｓ２６ｎｍｉｎｄｉａｍｅ－ｔｅｒ．ＴｈｅｒａｒｅｆｉｅｄＡＲｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅａｂｌｅｔｏｓｕｒｖｉｖｅＲＮａｓｅＡａｎｄｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｔａｂｌｅ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＶＬＰｓ）ｗａｓｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｔｏ１０８．５６ＰＦＵ／ｍＬｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ．ＴｈｅＨｉｓ－ｔａｇｇｅｄＡＲｐａｒｔｉ－ｃｌｅｓｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅｑｕａｌｉｔｙ－ｃｏｎｔｒｏｌｆｏｒＰＰＲＶｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｅｓｔｅｄｅｓｐｅｔｉｔｓｒｕｍｉｎａｎｔｓ（ＰＰＲ）；ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＶＬＰｓ）；６Ｈｉｓ－ｔａｇｓ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｑｕａｎ－ｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓ
小反刍兽疫作为一种高度接触性、急性、跨国性动物传染病，具有患病率及死亡率高的特点，易感动物主要是山羊和绵羊，被世界动物卫生组织（ＯＩＥ）规定为Ａ类动物疫病。

该病自发生起一直呈现不断蔓延的趋势。

２０１４年初，甘肃省武威市古浪县、内蒙古巴彦淖尔市乌拉特后旗和杭锦旗、宁夏吴忠
收稿日期：２０１４－０２－２６；修回日期：２０１４－０９－１９
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（２０１３ＢＡＤ１２Ｂ０１）；中国检验检疫科学研究院基本科研业务费专项资金资助项目（２０１３ＪＫ００５）
作者简介：邓俊花（１９８０－），女，山东泰安人，助理研究员，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｎｇｑｉｆｅｉ－１９８８２５＠１６３．ｃｏｍ。

＊通信作者，研究员，博士生，主要从事动物检疫工作，Ｔｅｌ：０１０－６４９２０３２２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｑｗｕ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
９９８中国兽医科学第４４卷
市盐池县先后发生小反刍兽疫疫情，给我国地方经济带来了严重损失。

目前，国内外许多研究者建立了多种小反刍兽疫病毒（ＰＲＲＶ）的ＲＴ－ＰＣＲ检测方法［１－７］。

ＯＩＥ（２０１３版）推荐了Ｃｏｕａｃｙ－Ｈｙｍａｎｎ等［１］建立的基于小反刍兽疫病毒Ｎ基因的一步法ＲＴ－ＰＣＲ作为ＰＰＲＶ检测的标准方法。

袁向芬等［８］也针对ＰＰＲＶＮ基因建立了一种通用型荧光ＲＴ－ＰＣＲ方法，其特异性和敏感性极高。

但是，在对病毒核酸的实际检测中，由于缺乏无生物安全的阳性质控物，使得小反刍兽疫病毒的检测方法很难做到全程监控、精准定量，因而在疫病检疫和诊断中无法推广应用该ＲＴ－ＰＣＲ方法。

利用ＡｍｏｒｅｄＲＮＡ技术制备的病毒样标准物质稳定、易保存、安全性高，能模拟天然病毒特性，与临床样本保持一致，可作为核酸提取、扩增和扩增后分析等各个环节的质控物，可有效克服传统ＲＮＡ标准物质存在的缺陷。

但是，现有的病毒样物质的制备技术工艺繁琐，并且病毒样颗粒溶液中还存在ＤＮＡ的干扰。

虽然有些研究人员从纯化的病毒样颗粒溶液中提取ＲＮＡ后，再进行ＤＮＡ酶：消化，以去除残存核酸干扰，但这样也会造成目的ＲＮＡ的损耗，无法做到病毒样物质的精准定量［９－１４］。

为此，本研究通过点突变技术改造了ＭＳ２噬菌体基因，将小反刍兽疫病毒Ｎ基因［８］插入改造后的病毒样颗粒载体中，采用组氨酸蛋白标签纯化技术制备高纯度的病毒样颗粒，将为口岸监控小反刍兽疫疫情提供高效的阳性参比标准物，同时为病毒样颗粒制备技术的推广和应用提供借鉴。

ＴＲＩｚｏｌ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品。

Ｏｎｅ－ＳｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ为ＫＡＰＡ公司产品。

核酸蛋白测定仪由美国Ｔｈｅｒｍｏ公司生产，型号为ＮａｎｏＤｒｏｐ－１０００。

伯乐ｉＱ５荧光ＰＣＲ仪由伯乐公司生产。

１〃３病毒样颗粒载体ｐＴｒｃＭＳ的构建
以ｐＴｒｃＨｉｓ－ＭＳ２质粒为模板，分别以Ｐｒｉｍｅｒ１（Ｐｒｉｍｅｒ１－Ｆ：５′－ＡＧＧＴＡＡＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣ－
ＴＴ－３′，Ｐｒｉｍｅｒ１－Ｒ：５′－ＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣ－
ＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡ－３′）
和Ｐｒｉｍｅｒ２（Ｐｒｉｍｅｒ２－Ｆ：５′－ＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴ－ＧＧＴＧＡＴＧＴＣＣＧＣＣＡＴＴＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＣＧ－３′，Ｐｒｉｍｅｒ２－Ｒ：５′－ＧＴＴＣＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴ－
ＴＣＣＣ－３′）为引物对，用ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲＨＳＤＮＡ聚合
酶分别进行ＰＣＲ扩增。

ＰＣＲ扩增反应体系为：５×
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ缓冲液（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）１０μＬ，ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡ聚合酶１．３Ｕ，ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ，Ｐｒｉｍｅｒ１（１０ｐｍｏｌ／μＬ）各１μＬ，
Ｐｒｉｍｅｒ２（１０ｐｍｏｌ／μＬ）各１μＬ，ｐＴｒｃＨｉｓ－ＭＳ２质粒
１０ｎｇ，用ｄｄＨ２Ｏ补至５０μＬ。

ＰＣＲ扩增的循环程
序为：９８℃变性１０ｓ，５５℃退火１０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。

扩增产物被命名为
ＰＣＲ产物：、；。

将扩增产物纯化回收，保存备用。

采用Ｘｈｏ：＋Ｈｉｎｄ＜限制性内切酶双酶切ｐＴｒｃＨｉｓ－ＭＳ２质粒。

体系如下：Ｘｈｏ：、Ｈｉｎｄ＜限制
性内切酶各１０Ｕ，１０×缓冲液５μＬ，模板１μｇ，补水至５０μＬ。

３７℃酶切２ｈ后，分别将酶切产物进
行胶回收纯化，命名为ＶｅｃｔｏｒＤＮＡ（Ｘ／Ｈ）。

使用Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ克隆试剂盒，
将ＰＣＲ产物：、ＰＣＲ产物；和ＶｅｃｔｏｒＤＮＡ（Ｘ／Ｈ）
１材料与方法连接。

反应体系及条件如下：ＰＣＲ产物：５０ｎ
ｇ，
１〃１质粒和细胞毒
ｐＴｒｃＨｉｓ－ＭＳ２质粒［１５］及ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｎ３８２［８］质粒均由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所菌
种保存实验室保存。

ＰＰＲＶ细胞培养弱毒购自新疆天康生物制药公司，由中国检验检疫科学研究院复
苏培养后，灭活处理用于检测，效价为７×１０５．１ＰＦＵ／ｍＬ，－８０℃保存。

１〃２主要试剂及仪器
ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲＨＳＤＮＡ聚合酶，ＩＰＴＧ固体粉末，Ｘｈｏ：、Ｈｉｎｄ＜及Ｋｐｎ：限制性内切酶均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤ
ＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ克隆试剂盒为Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司产品。

大肠杆菌感受态细胞ＪＭ１０９为北京全式金生物技术有限公司产品。

ＭａｇｎｅＨｉｓＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ蛋白纯化试剂盒为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品。

ＰＣＲ产物；５０ｎｇ，ＶｅｃｔｏｒＤＮＡ（Ｘ／Ｈ）３００ｎｇ，５× Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＥｎｚｙｍｅＰｒｅｍｉｘ连接酶预混液２μＬ，补水至１０μＬ。

５０℃连接１５ｍｉｎ后，取连接产物２．５μＬ热转化至大肠杆菌感受态细胞ＪＭ１０９，３７℃ 过夜培养，挑取阳性菌落进行测序鉴定，将测序正确
的质粒命名为ｐＴｒｃＭＳ。

１〃４重组质粒ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ的制备
将ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｎ３８２质粒和ｐＴｒｃＭＳ质粒分别进
行Ｋｐｎ：＋Ｈｉｎｄ＜双酶切，胶回收纯化，连接，转化，挑单克隆摇菌，以ＰＰＲＶ－Ｆ和ＰＰＲＶ－Ｒ［ＰＰＲＶ－
Ｆ：ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧ－
ＡＡＧ（下划线处为Ｋｐｎ：酶切位点），ＰＰＲＶ－Ｒ：
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＴＣＣＴＴＧＴＣＧＴＴ（下划线处为Ｈｉｎｄ＜酶切位点）］为引物进行ＰＣＲ鉴定，阳性克隆测序。

将重组质粒命名为ｐＴｒｃＭＳ－
第１０期邓俊花等：小反刍兽疫病毒样颗粒的构建及定量分析９９９
ＰＰＲＶ。

１〃５ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样颗粒溶液的制备
ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ重组菌体采用ＩＰＴＧ（终浓度为
０．５ｍｏｌ／Ｌ）于２８℃诱导表达１６ｈ，５０００ｒ／ｍｉｎ离心
１０ｍｉｎ，收集菌体。

菌体加入ＦａｓｔＢｒｅａｋＣｅｌｌＬｙｓｉｓＲｅａｇｅｎｔ（１０×）细胞裂解液破碎细胞，离心收集上清。

对上清采用ＭａｇｎｅＨｉｓＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ蛋白纯化系统进行纯化，回收上清即为纯化
后的病毒样颗粒ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ。

随后将ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ表达产物破碎离心，对其上清和沉淀分别进
行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，以检测其可溶性。

１〃６ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样颗粒溶液的纯度检测以上述回收的病毒样颗粒溶液１００μＬ为样本，采用ＴＲＩｚｏｌ试剂，按照操作说明书提取总ＲＮＡ后，分别以ＰＰＲＶ－Ｆ和ＰＰＲＶ－Ｒ为引物进行ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ鉴定，以验证纯化的病毒样颗粒溶液有无ＤＮＡ污染。

１〃７ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样物质的特性鉴定１．７．１加热变性试验将５０μＬ纯化的病毒样颗粒溶液于８０℃加热５ｍｉｎ，观察溶液变化。

对样品进行１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测，以未加热样品作
为对照。

１．７．２保存期试验将每管５０μＬ纯化的病毒样颗粒溶液以常温分别静置１、１０、２０、３０、６０ｄ，观察该
溶液有无沉淀。

样品ＲＮＡ提取后进行ＲＴ－ＰＣＲ，以验证病毒样颗粒有无降解现象。

１．７．３ＲＮＡ酶Ａ降解试验在每管５０μＬ的病毒样颗粒溶液中分别加入ＲＮＡ酶Ａ（１ｍｇ／ｍＬ）１、２、３、４μＬ后，放入３７℃３０ｍｉｎ，对照组不加ＲＮＡ酶Ａ。

所有样品均进行ＲＮＡ抽提，进行ＲＴ－ＰＣＲ检测。

１．７．４形态学观察对纯化后的病毒样颗粒溶液先进行１０ｇ／Ｌ醋酸双氧铀染色，自然干燥后，进行透射电子显微镜形态观察。

１〃８ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样颗粒质控体系的建立１．８．１ＰＰＲＶ细胞灭活毒ＲＮＡ标准曲线的绘制取ＰＰＲＶ细胞培养灭活毒１ｍＬ，采用ＴＲＩｚｏｌ试剂，按照操作说明书提取总ＲＮＡ。

采用Ｏｎｅ－ｓｔｅｐｑＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ进行ＰＣＲ扩增：１０×ＯｎｅｓｔｅｐＲＮＡＰＣＲ缓冲液２．５μＬ，ｄＮＴＰ混合液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，氯化镁（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）５．０μＬ，禽源Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，ＰＰＲＶＮ８５Ｕ、８５Ｒ［８］（１０ｐｍｏｌ／μＬ）各１μＬ，ＰＰＲＶＮ８５Ｐ［８］（１０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ，ＲＮＡ２
μＬ，用ｄｄＨ２Ｏ补足２０μＬ。

采用伯乐ｉＱ５荧光ＰＣＲ仪进行荧光信号采集：４２℃５ｍｉｎ；９５℃２ｍｉｎ；９５
℃ １０ｓ，６０℃ ２０ｓ，４０个循环。

以１０倍系列稀释的总ＲＮＡ作为模板进行扩增，得到扩增的标准曲线。

１．８．２ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样颗粒溶液的定量分析取含ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ纯化病毒样颗粒溶液进
行１０倍系列稀释，取１０－５稀释液１ｍＬ，抽提ＲＮＡ。

采用上述ＲＴ－ＰＣＲ体系进行扩增，获取扩增Ｃｔ值。

借助绘制的标准曲线和Ｃｔ值对病毒样颗粒溶液进行定量分析。

２结果
２〃１病毒样颗粒载体ｐＴｒｃＭＳ的建模
采用蛋白三维模拟器（ＳＷＩＳＳ－ｍｏｄｅｌ）分别对噬
菌体ＭＳ２中外壳蛋白改造前后的三维构象进行建
模（见图１Ａ和Ｂ）。

通过对比得出，在噬菌体ＭＳ２
的外壳蛋白第１５位和第１６位氨基酸之间插入６× Ｈｉｓ，不会改变噬菌体ＭＳ２外壳蛋白的整体构象。

图１噬菌体ＭＳ２中外壳蛋白改造的蛋白质三维构象模型对比分析
Ｆｉｇ〃１Ｃｏｎｔｒａｓｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆ３ＤｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｏｆｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｒｅｆｏｒｍｉｎｇｉｎＭＳ２ｐｈａｇｅ
Ａ：噬菌体ＭＳ２中外壳蛋白改造前的蛋白三维构象模型；Ｂ：噬菌体ＭＳ２中外壳蛋白改造后的蛋白三维构象模型
Ａ：３ＤｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｏｆｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｂｅｆｏｒｅｒｅｆｏｒｍｉｎＭＳ２
ｐｈａｇｅ；Ｂ：３ＤｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｏｆｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎａｆｔｅｒｒｅｆｏｒｍｉｎＭＳ２ｐ
ｈａｇｅ
２〃２ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ重组菌的表达及可溶性分析ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ重组菌进行原核表达，表达产
物破碎离心后进行蛋白电泳鉴定。

结果（见图２）显示，目的蛋白位于１０～１７ｋｕ之间，与ＭＳ２噬菌体
外壳蛋白（１３．７ｋｕ）大小相符。

表达产物破碎后通
过对比上清和沉淀中目的蛋白的含量，说明ｐＴｒｃ－
ＭＳ－ＰＰＲＶ产物是可溶的。

２〃３ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样颗粒溶液的纯度检测纯化产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果（见图３）显示，目的蛋白位于１０ｋｕ与１７ｋｕ之间，与ＭＳ２噬菌
体外壳蛋白（１３．７ｋｕ）的大小相符，且仅有一条目的
条带存在，表明纯化效果良好。

纯化产物提取ＲＮＡ
１０００
中国兽医科学 第 ４４卷
后，分别进 行 ＰＣＲ 和 ＲＴ－ＰＣＲ 扩 增 鉴 定，结 果 （见 图４）显示，ＰＣＲ 扩增呈阴性，ＲＴ－ＰＣＲ 扩增呈阳性。

结果表明，纯 化回收的 ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 中 含 有 全 长 的 ＰＰＲＶ 目的 ＲＮＡ，并且 ＤＮＡ 检测呈阴性。

２〃５ ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ
病毒样颗粒溶液的保存试验 ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 病毒样颗粒溶液在常温条件下 随着放置时间的延长，无杂质沉淀。

用抽提的 ＲＮＡ
进行的 ＰＣＲ 结果表明，此 物质无明显降解现象 （见 图６）。

用 ＲＮＡ
酶 Ａ 处 理 的 病 毒 样 颗 粒 溶 液 与 对 照组样品分别进行 ＲＴ－ＰＣＲ 鉴定，检测结果无明显 变化，表明制备的病毒 样颗粒溶液能够抵抗 ＲＮＡ 酶 Ａ 的降解（见图７）。

图 ２ ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 纯化蛋白的 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
分析 Ｆｉｇ〃２ ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙ
ｓｉｓｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｐＴｒｃ－ ＭＳ－
ＰＰＲＶ Ｍ：蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 ；１：ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 重 组 全 菌 ；２：ｐＴｒｃＭＳ－ ＰＰＲＶ 诱导表达产物上清 ；３：ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 诱 导 表 达 产 物 沉 淀 ；４： ｐＴｒｃＭＳ－
ＰＰＲＶ 诱导表达产物全菌 Ｍ：Ｓｐｅｃｔｒａ ＭｕｌｔｉｃｏｌｏｒＬｏｗ ＲａｎｇｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ；１：Ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶｂｅｆｏｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；２：Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｆｒｏｍ ｐＴｒｃＭＳ－ ＰＰＲＶｌｙｓａｔｅａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；３：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｆｒｏｍ ｐＴｒｃＭＳ－ ＰＰＲＶｌｙｓａｔｅａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；４：Ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍ ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ ｌｙｓａｔｅａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
图 ４ ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 病毒样颗粒溶液的 ＰＣＲ 鉴定
Ｆｉｇ
〃４ ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ ＶＬＰｓ ｂｙＰ
ＣＲ Ｍ：ＤＮＡ 分子质量标准 ；１：ＰＣＲ 产物 ；２：ＲＴ－
ＰＣＲ 产物 Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ；２：ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ
图 ３ ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 病毒样颗粒溶液的 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 分析 Ｆｉｇ〃３ ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙ
ｓｉｓｏｆｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ ＶＬＰｓ
Ｍ：蛋 白质分子质量标准 ；１：ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 的纯化蛋白 Ｍ：Ｓｐｅｃｔｒａ ＭｕｌｔｉｃｏｌｏｒＬｏｗ ＲａｎｇｅＰｒｏｔｅｉｎＬａｄｄｅｒ；１：Ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ
２〃４ 加热变性试验
肉眼观察到，纯化的病毒样颗 粒溶液由透明状 变成淡乳白 色。

电 泳 鉴 定 结 果 （见 图 ５）显 示，加 热 后溶液电泳条带呈弥散性，此 ＲＮＡ－蛋 白 复 合 体 中 蛋白外壳变性，包裹核酸被释放出 ，说明此病毒样颗 粒中包裹有 ＲＮＡ 核酸，而不是 ＤＮＡ。

图 ５ ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 病毒样物质的加热分析
Ｆｉｇ〃５ ＨｅａｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ ＶＬＰｓ Ｍ：ＤＮＡ
分子质量标准 ；１：纯 化的病毒样物质 ；２：病 毒样颗粒 加热 后 的产物 Ｍ：ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１：Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＶＬＰｓ；２：Ｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ ＶＬＰｓ ａｆｔｅｒｈｅａｔｉｎｇ
２〃６ 含 ｐ
ＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 病毒样颗粒溶液的电镜观察 纯化的病毒样颗粒溶液经 １０ｇ／Ｌ 醋 酸 双 氧 铀 染色后，透射电镜观察（见 图 ８）显 示，颗 粒为直径约
２６ｎｍ 的多边形物质。

２〃７ 含 ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ 病 毒 样 颗 粒 溶 液 定 量 体 系 的建立
将 ＰＰＲＶ 细 胞 培 养 灭 活 毒 提 取 的 ＲＮＡ 进 行 １０倍系列稀释，建 立 荧 光 ＲＴ－ＰＣＲ
体 系，并 绘 制 标
第１０期邓俊花等：小反刍兽疫病毒样颗粒的构建及定量分析１００１
准曲线。

结果，最终获得的标准曲线的线性方程为ｙ＝－３〃３２４６ｘ＋３９〃８１，ｒ２＝０．９９７１。

标准曲线见图９。

扩增，在此浓度下对应的Ｃｔ值为２４．５６，由标准方程得出推算公式为１０（Ｃｔ－３９．８１）／－３．３２４６。

经计算，该病毒样颗粒溶液的浓度相当于１０８．５６ＰＦＵ／ｍＬ。

图６ｐＴ
ｒｃＭＳ－ＰＰ
ＲＶ
病
毒样颗粒的稳定性检测
Ｆｉｇ〃６Ｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎａｌｙｓ
ｉｓｏｆｐＴ
ｒｃＭＳ－ＰＰ
ＲＶＶ
Ｌ
ＰｓＭ：ＤＮＡ
分子质量标准；１～
５：ＲＴ－ＰＣＲ产物（６０、３０、２０、１０、１ｄ）Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮ
ＡＭａｒｋｅｒ；１－５：ＲＴ－ＰＣＲｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ（６０ｄ，３０
ｄ，２０ｄ，１０ｄａｎｄ１ｄ，ｒｅｓ
ｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）
图７ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样颗粒抗ＲＮＡ酶Ａ的稳定性检测
Ｆｉｇ〃７Ａｎｔｉ－ＲＮａｓｅＡｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ
ＶＬＰｓ
Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１～４：ＲＴ－ＰＣＲ产物（ＲＮＡ酶Ａ的量分别为１、
２、３、４μｇ）；５：对照组的ＲＴ－ＰＣＲ产物；６：阴性对照Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡＭ
ａｒｋｅｒ；１－４：ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ（１，２，３ａｎｄ４μｇｏｆＲＮａｓｅＡ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌ
ｙ）；５：ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ（０μｇＲＮａｓｅＡ）；６：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ
图８ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样颗粒的透射电镜观察２０００００×
Ｆｉｇ〃８ＥｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶＶＬＰｓ
将含ｐＴｒｃＭＳ－ＰＰＲＶ病毒样颗粒溶液做１０倍
系列稀释，取１０－５稀释液提取ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ
图９ＰＰＲＶ荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测ＲＮＡ的标准曲线
Ｆｉｇ〃９Ｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅ
ｔｈｏｄｏｆＰＰＲＶ
３讨论
在病毒样颗粒制备技术中，目前主要存在两大问
题：（１）纯化问题。

病毒样颗粒重组基因成功构建后
进行表达。

在表达产物破碎后，均使用了ＤＮＡ
酶：和ＲＮＡ酶Ａ进行消化以去除ＤＮＡ和ＲＮＡ，
但此方法很难除尽核酸以达到纯化病毒液的目的。

这就为ＰＣＲ鉴定病毒液的纯度增加了困难，很容易产
生假阳性。

虽然在ＲＮＡ提取后，再进行了酶消化，
以去除残存核酸的干扰，但此时，核酸酶用量大，
制备的ＲＮＡ有很大损失，造成下一步定量不准确。

（２）定量问题。

由于病毒样颗粒溶液中或多或少存
在核酸和杂蛋白，通过测定其光密度值无法精确病
毒样颗粒溶液的浓度，使得在此基础上建立的检测
方法不能达到真正意义上的定量。

本研究通过基因插入方法，将ＭＳ２噬菌体中外
壳蛋白的第１５～１６位氨基酸之间加入６×Ｈｉｓ纯化
标签，这样含外源基因的病毒样颗粒表达产物为
ＲＮＡ－蛋白质复合体，利用纯化蛋白方法捕获病毒
１００２中国兽医科学第４４卷
样颗粒，可以简化病毒样颗粒制备的繁琐操作过程，同时提高病毒样颗粒纯化的质量。

目前的研究表明，仅通过改造噬菌体外壳蛋白的氨基酸，就大大减少了病毒样颗粒的数量，这可能与外壳蛋白空间结
构发生改变，造成外壳蛋白折叠效率降低有关。

因此，笔者目前构建的ｐＴｒｃＭＳ载体还有待做进一步改造。

病毒样物质作为质控体系的一部分，其纯度和稳定性对于试剂盒的质量至关重要。

本研究将组氨酸标签插入病毒样颗粒的外壳蛋白中，利用镍离子树脂亲和纯化制备出完整的高纯度病毒颗粒，使病毒的制备纯化更加简化。

在４℃条件下，病毒样颗粒在ＳＭ缓冲液中可稳定保存１年以上，稳定性和可操作性大大优于裸露的ＲＮＡ，以其作为质控品或内标完全可以满足试剂盒对其稳定性的要求。

虽然病毒样物质是一种ＲＮＡ－蛋白复合体，但它不同于常规蛋白，长期放置无沉淀，均匀的存在于溶液中，这样就便于稀释进行后续对比验证试验。

改造后的病毒样物质的纯度大大提高，如果因为环境和操作等因素，造成抽提的ＲＮＡ混入ＤＮＡ污染，也可通过酶进一步消化以除去干扰。

本试验以已知浓度的细胞灭活毒绘制标准曲线，对等量的病毒样颗粒溶液提取ＲＮＡ，然后通过荧光ＲＴ－ＰＣＲ方法获得其相应的Ｃｔ值，依据推算公式获得其实际
２３２－２３６．
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量检测提供了可靠的标准品。

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（责任编辑胡弘博）。