实验五 小鼠骨髓细胞微核试验 PPT课件

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经口急性毒性 实验
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2. 实验原理
微核试验是用于染色体损伤和干扰细 胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。 微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗 粒，大小相当于细胞直径的1/20～1/5， 呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致， 在间期细胞中可以出现一个或多个。一般 认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受 影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核 外的遗传物质。
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4. 实验步骤
求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。 考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒 的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天 染毒一次，连续4天，第5天取样。这样，取样 一次就能覆盖24～72h高峰，如果高峰延迟到 96h也不会漏掉。 4.剂量选择：受试化学毒物的最大剂量除受溶 解度大小所限外，应达到最大耐受量。一般情 况下，应设3～5个或更多剂量组，剂量覆盖的 范围要达到3个数量级以上。同时还应设立阳性 对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰 胺(50-100mg/kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)腹腔注 射1次或2次。阴性对照组使用等体积的溶剂。
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6. 注意事项
1.良好的骨髓涂片及良好的染色，是本实 验的关键步骤。 2.熟悉并正确区分跟中骨髓细胞。
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微核1
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微核2
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4. 实验步骤
二、骨髓液的制备和涂片
试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈 椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖 板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨， 擦净血污，剔去肌肉，剪去股骨两端，用小型弯 止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片 上，混合均匀后推片。也可在动物处死后，迅速 用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理 盐水洗去血污和碎肉，剪去股骨两端，用带针头 的2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔内，将骨 髓冲人离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均 匀，以1000r／min离心10min，弃去多余的上清液， 留下约0.5ml
五、观察计数
先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色 较好的区域，再在油镜下观察计数，PCE细胞呈 灰蓝色，正染红细胞(NCE)呈橘黄色。细胞中含 有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与 核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出 现一个或多个微核。计数1000个PCE中含微核的 PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。
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5. 结果分析
本试验中只计数PCE中的微核，微核率以千分 率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄 动物分别计算微核PCE的均值。雌、雄动物之间 无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分 别进行计算；正常的PCE／NCE比值约为1(正常范 围为0.6～1.2)。如比值<0.1，则表示PCE形成 受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验 结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发 生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道 结果或者是与研究的历史数据相一致。
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3. 实验材料
实验动物：
体重18-22g小鼠，雌雄对半。
实验器材：
手术剪、晾片架、眼科剪、眼科镊、 显微镜、饲养笼等。
实验试剂：
甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、小牛 血清、生理盐水、环磷酰胺。
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2. 实验原理
所以，微核试验能检测化学毒物或物理因 素诱导产生的染色体完整性改变和染色体 分离改变这两种遗传学终点。
微核可以出现在多种细胞中，但在有 核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物 相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次 分离后数小时可将主核排出，而仍保留微 核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中 的微核。
四、染色
将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa应 用液(Giemsa储备液l份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9 份)染色10-15min，然后冲洗掉玻片上的染色液， 置晾片架上晾干。
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4. 实验步骤
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4. 实验步骤
一、试验动物及处理
1.动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。 以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7-12 周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。 2.染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性 质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道 及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与 人体接触化学毒物相同的途径。 3.染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需 在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作 用。不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间也 不尽相同。波动范围可以达到24～72h。这就要
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食品专业
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院 系：生化环院 任课老师：吴雨龙 任课班级：09食品、行09食品
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1. 实验目的
1.
通过本次实验,学习和掌握小鼠骨髓 多染红细胞(PCE)微核的测定方法，了解 环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。
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4. 实验步骤
与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的 载玻片上推片。阳性及阴性对照组按上述方法同 时进行处理。
三、固定
将推好晾干的骨髓片放人染色缸中，用甲醇溶 液固定15min，取出晾干。不能及时染色的涂片 也应固定后保存。