白芍高效液相色谱指纹图谱的研究

白芍高效液相色谱指纹图谱的研究【摘要】目的研究白芍的高效液相色谱指纹图谱，为科学评判及有效操纵其质量提供靠得住方式。

方式利用HPLC方式，梯度洗脱，测定了21批白芍样品。

色谱条件为：Hypersil C18柱（ mm×200 mm，5 μm），流速 ml/min,柱温25℃，流动相A为乙腈；流动相B为%磷酸水，流动相A梯度洗脱(95%～65%乙腈)，分析时刻为60 min，时刻为0，15，25，60 min，A(%)为95%，86%，86%，65%。

结果21批白芍样品取得包括芍药苷（7号峰)在内的14个共有峰。

聚类分析和相似度分析结果一致。

结论白芍的指纹图谱特点性及专属性强，可用于全面操纵白芍的质量，确保每批产品的均一性。

【关键词】白芍芍药苷高效液相色谱指纹图谱
Abstract：ObjectiveTo establish a sensitive and specific HPLC method for controlling the quality of Radix Paeoniae Alba．MethodsHPLC method was applied for quality assessment of Radix Paeoniae Alba．Column：Hypersil C18 column （ mm×200 mm，5μm）；flow-rate： ml/min；column temperature：25℃; mobile phase：acetonitrile（A）and H2O (acidified to % with phosphoric acid)(B). The concentrations of solvent A were 95%，86%，86%and 65%at 0，15，25,60 min，respectively．ResultsThe HPLC chromatographic fingerprint of Radix Paeoniae Alba，showing 14
characteristic peaks，was established from 21 lots of Radix Paeoniae Alba products．The results of similarity analysis was the same as that of herarchical cluster chromatographic fingerprint of Radix Paeoniae Alba with high specificity can be used to control its quality and assure to lot consistency．
Key words：Radix Paeoniae Alba； Paeontflorin； HPLC；Fingerprinting
白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall的干燥根。

文献［1］报导，其要紧成份为芍药苷（paeoniflorin）、芍药内脂苷（albiflorin）、氧化芍药苷（oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍药苷（benzoylpaeoniflorin），通称芍药总苷（total glucosides of paeony， TGP）。

具有抗炎、抗病毒、解痉镇痛、护肝等多种药理活性［2～4］。

色谱指纹图谱方式是评判植物药质量的有效方式之一。

本文应用HPLC方式对白芍指纹图谱进行了研究,以期为全面操纵白芍质量提供靠得住方式。

1 仪器与试药
仪器高效液相色谱仪(四元泵、柱温箱、MVD和DAD检测器，Agilent1100 色谱工作站)、电子分析天平AE240 （十万分之一，瑞
士，METTLER-TOLEDO Co.）、CQ250超声波清洗器（上海超声波仪器厂）；UV-3300（日今日立公司）。

对照品与对照药材芍药苷对照品（编号0900-200102，含量测定用）；白芍对照药材（批号1243-0301），均购于中国药品生物制品检定所。

白芍药材经江西中医学院药用植物学科组鉴定符合2000年版《中国药典》白芍项下标准。

乙腈为色谱纯（Merk Co.），水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。

2 方式与结果
色谱条件色谱柱为Hypersil C18柱（ mm×200 mm，5 μm）（大连Elite公司）；流动相为A：乙腈；B：%磷酸水；柱温25℃。

线性梯度见表1。

表1 梯度洗脱（略）
检测波长确信取样品溶液，别离在210，230，254，272 nm 处检测。

结果说明，254，272 nm处各色谱峰之间分离度好，但峰数少；210 nm检测，峰数与230 nm检测大体一致，但基线不稳固，不能准确积分；以230 nm检测，峰数多，基线平稳，应选之。

提取方式的考察本实验对甲醇、95%乙醇索氏提取，甲醇、50%乙醇回流提取，甲醇、95%乙醇超声提取，对提取溶剂、提取方式
进行了考察。

结果说明，95%乙醇超声提取45 min后,所得色谱峰的峰数为最多。

后又对50%，75%，95%乙醇超声提取进行实验，发觉三者之间峰数无显著性转变，本文采纳50%乙醇作为提取溶剂进行超声提取。

对照药材和供试品溶液的制备周密称取对照药材和样品干燥粉末各 g，分置50 ml量瓶中，周密加入50%乙醇50 ml，称定重量，超声提取45 min，冷却，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1 ml，用流动相（乙腈%磷酸水（12∶88））稀释至10 ml，摇匀，过μm滤膜，各取续滤液作为对照药材溶液和供试品溶液。

对照品（参照物）溶液制备周密称取芍药苷对照品适量，加50%乙醇制成每毫升含80 μg的溶液，即得。

色谱条件的确立依照上述结果，最终确立的色谱条件为：色谱柱：Hypersil C18柱（ mm×200 mm，5μm）（大连Elite公司）流动相：乙腈%磷酸水，梯度见表1；检测UV 230 nm；流速 ml/min；柱温:25℃。

在上述色谱条件下，取对照品溶液、对照药材溶液和样品溶液各进样10 μl进行HPLC-FP测定，结果对照药材与样品中的各个峰分离较好，对照品芍药苷峰与样品中芍药苷峰保留时刻一致，而且与样品中其它组分达到了专门好的分离。

周密度实验周密称取12号样品，按供试品溶液制备方式操作，持续进样6次，记录其指纹图谱。

用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评判系统的操作标准”软件(版本 2004 A)处置数据，结果说明，各色谱峰的相对保留时刻和其相对峰面积比值相当一致，RSD为%～%，小于%，符合指纹图谱的要求。

稳固性实验周密称取12号样品，按供试品溶液制备方式操作，别离在0，2，4，8，16，24 h检测，记录其指纹图谱。

结果说明，各色谱峰的相对保留时刻和其相对峰面积比值一致，RSD为%～%，小于%，符合指纹图谱的要求。

重现性实验周密称取12号样品，按供试品溶液制备方式操作，持续进样6次，记录其指纹图谱。

结果说明，各色谱峰的相对保留时刻和其相对峰面积比值相当一致，RSD为%～%，小于%，符合指纹图谱的要求。

白芍HPLC-FP测定周密吸取对照品（参照物）溶液、对照药材溶液和供试品溶液各进样10 μl测定，结果见图2。

7号峰为芍药苷，以7号峰为内参比峰，以其它色谱峰对内参比峰的相对保留时刻定性，计算各色谱峰相关于其内参比峰的峰面积比。

从中确信了14个共有峰，其相对保留时刻构筑了白芍样品的HPLC指纹特点，可作为定性辨别的依据；用相对峰面积比那么反映了白芍药材的定量不同。

数据处置
白芍样品1系统聚类分析系统聚类分析是一种无治理、无指导的模式识别方式，是依照事物本身的特点研究个体分类的方式，可依据所测样品的色谱指纹图谱特点数据，对样品进行分类。

本研究以经形态学鉴定的21个不同批次和产地的白芍样品为研究对象，进行指纹图谱研究，取得包括芍药苷（7号峰)在内的14个色谱峰。

将各色谱峰相关于内参比色谱峰的峰面积量化，取得21×14阶原始数据矩阵，运用“SPSS软件”对其进行系统聚类分析，采纳组间均联法（between-groups linkage），利用欧氏距离(Euclidean)作为样品的测度。

聚类分析将21个白芍样品分为3类。

白芍样品2相似度计算指纹图谱反映的是样品整体的特点，进行指纹图谱比较，能够反映样品之间的亲疏程度，可是单纯的直观比较指纹图谱的峰的多少和峰的大小，只是定性比较，而且又带有个人的主观性。

相似度能够定量的描述指纹图谱。

本实验采纳国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评判系统的操作标准”软件(版本 2004 A)处置数据。

结合系统聚类分析结果，得知相似度在～之间归为第1类；～之间归为第2类；相似度低于归为第3类。

本实验结果显示，采纳两
种不同测度的相似度查验白芍的指纹图谱，趋势是一致的，取得了两种不同测度之间的彼此认证。

另外，用该法分析未知样品时，只需测得该样品的色谱指纹图谱，计算未知样品与共有模式间的相似度，即可对样品进行鉴定、分类和评判。

b 系统聚类分析和相似度计算对白芍样品进行的HPLC色谱指纹图谱研究方式，在必然程度上能够反映和评判中药质量的好坏，是一种易于推行的科学评判方式，是对评判中药材质量的方式进行的有利的尝试。

若是结合白芍的药理学研究和选取足够样品，能加倍全面地对白芍进行质量评判，其质量操纵会加倍完善和科学。

【参考文献】
［1］Huang TK．Handbook of the Composition and Pharmacology of Common Chinese Drugs(经常使用中药化学成份和药理手册)［Z］.Bcijing：China Medico-Pharmaceutical Sciences and Technology Publishing House，1994，745.
［2］Li J，Liang JS，Zhou AW．et al．Modulatory effects of total glucosides of paeony on B lymphocyte proliferation and interleukin 1 production［J］.Chin J Pharmacol Toxicol(中国药
理学与毒理学杂志)，1994,8(1)：53.
［3］Lang JS，Chen MZ，Xu SY．Effects of total glucosides of paeony on the function of peritoneal macrophages in rats ［J］.Chin J Pharmacol Toxicol(中国药理学与毒理学杂志), 1990,4(2)：153.
［4］Liang JS，Chen MZ，Xu SY．Effects of total glucosides of paeony(TGP)on adjuvant arthritis in rats［J］.Chin J Pharmacol Toxicol(中国药理学与毒理学杂志)，1990，4(4)：258.。