引物设计的原理和程序

1 引物的设计以及初步筛选
引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序 Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。

但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。

因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。

所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。

下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。

①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(F alse priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[21。

②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。

特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。

③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。

④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol[31。

⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairp in)，AG高于4．5 keal／mol时易引发上述两种结构的产生。

⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。

而以m RNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。

⑧5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物[2]。

只要掌握了以上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。

Primer Premier 5和Oligo 6可以在/soft/下载，primer3的主页位置在。

2 引物的二次筛选
引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。

本步应注意以下两点，一是得到的一系列引物分别在Genebank中进行回检。

也就是把每条引物在比对工具(/blas t/) 的blastnr中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。

一般连续10 bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免连续5-6 bp的同源。

二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点(例如/GENESCAN.html
的GENESCAN工具或者GeneParser软，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。

3 引物的最终评估
当我们经过初次筛选和二次筛选后得到的那对引物便可以用于合成，合成后我们经过PCR扩增可以对引物进行最终的评估。

一是PCR扩增的特异性和效率。

经过PCR
条件优化后能否获得特异性条带，即无目的条带之外的多余条带。

另外，PCR产物的量是否足够，即无不出带和条带很弱的现象。

二是以DNA为模板设计引物时，PCR扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。

如果相差太大G 于100 b ，有可能是错配产物。

三是是否形成引物二聚体带。

我们结合引物最终评估和测序的结果可以对引物设计的成败做出鉴定，为我们以后进行引物设计积累宝贵经验。

4 用比较基因组学分离新基因时引物设计的注意事项
扩增已知基因时经过初次筛选和二次筛选后得到的引物基本上能够满足要求，但是当运用比较基因组学分离新基因时，设计引物还应注意以下两点：① 模板的选择。

如果以DNA为模板设计引物，首先在Genebank中找到与待分离新基因同源的其它物种的该基因。

利用/blast/的Blast工具和 /elustalw/的Clustalw工具把已检索到的基因进行同源性比较，根据比较基因组定位的原理，选择研究深入、标记稠密的人和哺乳动物(如小鼠)保守功能基因DNA序列设计引物[51，该引物区段要求在各物种间绝对保守，差异不要大于2 bp，特别是3’端必须完全同源。

如果以电脑克隆策略获得的待分离物种新基因的EST一重叠群为模板设计引物，要求ESTs与信息探针之间同源性大于80％，长度大于100 bp，并且避免在EST的并接部位和可能的外显子与内含子剪接位点处设计引物。

②引物序列最好位于相临的外显子区且至少距离外显子
与内含子剪接处25 bD以上，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

PCR技术的基本原理
⑴PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。

在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板
5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延
伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

⑵PCR的反应动力学：PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列DNA 片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

⑶PCR扩增产物：可分为长产物片段和短产物片段两部分。

短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。

短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，
其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。

进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。

引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。

不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

引物设计的原理和程序（多图）
一、设计原理
1、择合适的靶序列:设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守，碱基分布均匀的区域进行引物设计。

2,、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15～30bp.
3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55～60℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。

若引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。

4、(G+C)含量:有效引物中(G+C)的比例一般为40～60%。

5、碱基的随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3 '端不应超过3个连续的G或C.
6、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，如回文结构，发夹结构等，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免3'末端的互补。

二、引物设计操作流程
序列下载
↓
同源性比较
↓
引物设计筛选
1、序列查找
根据所需检测的病原体或者待检特定基因，在/pubmed 网址查询有关序列。

2,同源性比较
主要有两种方法
1）在/blast/blast.cgi 网址进行在线的两两比较。

2）采用OMIGA, PCGENE等软件进行两两或多序列比较。

①打开OMIGA软件，导入(import)下载存盘的纯文本序列文件:
②选择待比较的多条序列，右键点击"align sequences"命令；
③等待计算机处理，直至状态显示排列结束，点击"alignment"显示结果；
④"alignment"结果，相同碱基以同色标记
三、引物设计与筛选Primer Premier 5.0软件为例，进行引物设计和筛选的操作示范
1、打开软件，调入序列
2、选择路径，选择序列文件名，加入右框
3、序列文件显示如图，点击"primer"；
4、按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击"确定"进行引物搜寻；
5、等待引物搜寻，显示结束后，点击"确定"，进入下一页；
6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，依次筛选
引物设计软件oligo应用图解
[ 2008-04-24 22:44:11 | Author: colacat ]
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。

它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。

Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG 图；Oligo 6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。

“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。

但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。

oligo的下载和安装我就不多说了，打开oligo相信也无需多讲。

打开oligo的页面如下：
单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口：
在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开”：选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”：
出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile”：
出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。

该频率高则可增加错误引发的可能性。

因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。

如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了：
∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5'端和中间值比较高，而在3'端相对低（如图）。

Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5'到3'的下降形状也有利于引物引发聚合反应。

Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。

选取引物时，宜选用3'端Frq值相对较低的片段：
再点击Search再点“Fo'r Primers and probes”或使用快捷键F3：
出现以下窗口，点“OK”就OK了。

当然你也可以点击“Prameters”和“Search Range”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度：
出现Search Status窗口，点“OK”：
出现Primer pairs窗口，#代表引物对的编号，依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量：
点击任一行出现“PCR”窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息：
关掉“PCR窗口”和“primer Pairs窗口”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置，图中手型鼠标所指即为引物序列：
至此引物设计已经完成，你可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等：
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。

首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。

需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。

二聚体形成的能值越高，越不符合要求。

一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。

第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。

一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。

当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。

这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。

第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。

有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。

好了，oligo使用的简单介绍到此结束。

在引物设计完之后可以使用软件自带的分析功能，操作如下：
点击“File”菜单中的“New Sequence”命令；
在窗口中输入上游引物；
如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字，如20；
点击Accept/Discard菜单的Accept命令；
如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；
选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；
从Edit菜单中选取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列；
在Edit窗口的上角处，输入相应的5’位置；
选取“Accept and Quit”命令；如果想让程序给出最佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比，一般哺乳动物的cDNA 序列中GC大约占44％。

点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。

关于引物的评价有几点：
duplex formation：这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，主要是看引物3‘端有无配对碱基(最好没有)。

其中的current oligo是当你对引物进行了编辑（如加入酶切位点）时，对原始引物进行的分析。

（下同）形成的二聚体要看能值G(得它不会输入啊！)，能值越低越好，最好不要超过4.5（下同）。

hairpin formation：这是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3’端不要形成发夹结构。

还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。

如果引物中加入酶切位点，可能会有发夹结构且能值不会太低，这就需要灵活控制退火温度了。

composition and Tm：分析上下游引物的碱基组成，GC比和Tm值，原则我就不多说了。

false priming site：如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其3‘端）是否与特定模板的其他位点结合。

一般错配的引发效率以不超过100为好，但并不绝对，如果正确结合位点的引发效率为450以上，而有一个错配的引发效率是120左右的，这个引物也是可以接受的！
PCR：总结性的显示引物位置，产物大小，Tm值等参数，你可以横向比较一下，尤其是给了一个optimal annealing tem还是可以参照一下地。

也给了简单的评价供参考。

引物主要的评价功能也就这些了，应付一些基本的引物分析足够了。

PCR基本原理与操作流程
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。

典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合
适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。

因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。

它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。

通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：
(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；
(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；
(3) 从cDNA中克隆某些基因；
(4) 生成大量DNA以进行序列测定；
(5) 突变的分析；
(6) 染色体步移；
(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

一、试剂准备
1. DNA模版
2．对应目的基因的特异引物
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix （2mM） 4 μl
引物1（10pM） 2 μl
引物2（10pM） 2 μl
Taq酶（2U/μl） 1 μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2．调整好反应程序。

将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。

一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s → 58℃30s → 72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化
PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。

各个组份都能影响PCR结果的好坏。

1．反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。

标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。

Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。

浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。

在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。

若样品中含EDTA 或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。

在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。

据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。

2．dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。

PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。

四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。

此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。

3．Taq DNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。

酶量过多将导致产生非特异性产物。

但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。

当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。

4．引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。

要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
1)引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。

应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。

2)引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。

3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。

两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。

3)人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。

4) 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。

一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。

一般用0.25-0.5pM/μl较好。

5)引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。

使用前取出其中一部分用ddH2O 配制成10μM或20μM的工作液。

5．模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。

虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA 或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。

原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。

6．PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。

四、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。

最好设立一个专用的PCR实验室。

２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。

一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。

操作过程中均应戴手套。

４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。