鼠伤寒沙门氏菌对肠道屏障的破坏作用

鼠伤寒沙门氏菌对肠道屏障的破坏作用
吴姚平;武晓丽;徐锋;付金衡
【摘要】为了研究鼠伤寒沙门氏菌对肠道屏障的破坏作用,应用小鼠结肠病理组织切片技术、蓝色葡聚糖2000渗透量检测并结合transwell细胞层模型和荧光定量PCR方法探寻鼠伤寒沙门氏菌破坏肠道屏障的可能机制.病理切片结果显示:鼠伤寒沙门氏菌感染可导致肠上皮细胞受损,Babl/c小鼠小肠外蓝色葡聚糖2000渗透量在2、4和6h升高(P＜0.05),昆明小鼠小肠外其渗透量在2和4h时显著升高(P＜0.005);细胞跨膜电阻值降低(P＜0.05);细胞间紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1基因mRNA转录水平下调(P＜0.005).结果表明,鼠伤寒沙门氏菌能够通过下词肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达来破坏细胞间的紧密连接结构,从而达到破坏肠道屏障的作用.补充阐明了鼠伤寒沙门氏菌感染对肠道屏障的影响,对揭示研究鼠伤寒沙门氏菌的致病机制提供一定依据.%In order to investigate the break of intestinal barrier after treated with Salmonella typhimurium,the intestinal histopathologic sections and dextran blue 2000 concentration,together with the transwell tight junction structure model and RT-qPCR technology,were used to seek the mechanism.The results of histologic section were showed that the intestinal epithelial cell and intestinal barrier were broken after treated with Salmonella typhimurium,and the relative concentration of dextran blue 2000 was increased in Babl/c(P＜0.05) and Kunming mice(P＜0.005) respectively after treated in 2 h and 4 h.The relative TEER value was decreased in Caco-2 model(P＜0.05) and the mRNA expressing (ZO-1,Claudin-1) was down-regulated(P＜0.001).All those above demonstrate that Salmonella typhimurium can make the
genes of tight junction protein related genes down-regulate expression,and then intestinal epithelial cell tight junction structure and intestinal harrier were broken.This research demonstrated the effect of intestinal tract treated by Salmonella typhimurium,and it is a significant for the deep study on pathogenicity of Salmonella typhimurium.
【期刊名称】《南昌大学学报（理科版）》
【年(卷),期】2017(041)003
【总页数】5页(P265-269)
【关键词】鼠伤寒沙门氏菌;Caco-2;紧密连接;肠道屏障
【作者】吴姚平;武晓丽;徐锋;付金衡
【作者单位】南昌大学生命科学学院,江西南昌 330031;江西中医药大学基础医学部,江西南昌 330004;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.9
肠道，既是营养物质吸收的主要器官，也是与肠道内细菌直接接触和作用的关键部位[1-2]。

肠道屏障分为机械屏障、免疫屏障、化学屏障和微生物屏障，其保证了
肠道在接触外源物质时，避免众多抗原物质和有毒物质的侵害[3]。

肠道机械屏障
由肠黏膜自身组成结构决定，由粘液层、肠上皮及细胞间紧密连接、固有层等组成，能够有效地避免肠道内细菌或其他抗原物质透过肠黏膜进入其他组织，而肠组织结构的完整性是这一功能的基础[4]。

选用一种不能被细胞吸收、分子量相对较大、
无害的标志物，是检测肠道机械屏障是否完整的一种方法，当肠道屏障被破坏时，其渗透量上升[5]。

在细胞水平，用Caco-2细胞建立单层膜模型，测量细胞跨膜
电阻值也是一种简单有效的方法，当细胞间紧密连接程度降低时，溶液中离子更容易通过细胞间隙，电阻值减小[6]。

测定构成紧密连接结构的蛋白质及相关基因的
表达水平，也是一种间接反映紧密连接结构状态的有效手段[7]。

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，是常见的食源性致病菌，能够引起肠胃炎，严重时导致死亡[8]。

鼠伤寒沙门氏菌
对肠上皮细胞有着极强的粘附能力，能过黏附在肠道上皮细胞表面，并在肠道中特定地聚集在一起[9-10]。

有研究表明，沙门氏菌能够侵入胞内，引起细胞骨架结构重排，并且能够激活有关的转录因子，刺激和诱导细胞核内炎性细胞因子相关基因的转录表达，促使细胞和机体产生炎症反应，而这些炎性因子能够帮助菌体穿越肠道免疫屏障进入机体内部[11]。

在Caco-2细胞单层模型中，沙门氏菌能够破坏
ZO-1结构，使紧密连接结构遭到破坏[12]。

然而目前为止，尚未发现有针对鼠伤寒沙门氏菌通过Claudin-1和Occludin蛋白影响肠道机械屏障的报道。

Claudins 是直接构成细胞间紧密连接的重要蛋白质，维持细胞膜功能；Occludin参与上皮
细胞间隙的封闭，本文期望在证明鼠伤寒沙门氏菌破坏肠道屏障的基础上，进一步探究其对机械屏障相关的紧密连接蛋白的影响，为阐明鼠伤寒沙门氏菌破坏肠道屏障的分子机制提供新的研究思路。

1.1 材料
1.1.1 菌株和细胞鼠伤寒沙门氏菌菌株和Caco-2细胞均由本实验室保存并提供。

1.1.2 动物 Babl/c小鼠和昆明小鼠，均为4～6周龄的雌性小鼠，由南昌大学动物科学技术部提供。

1.1.3 主要设备和试剂设备：细胞电阻仪，细胞计数仪，分光光度计，Bio-rad CFX 96荧光定量仪，离心机等。

试剂：LB培养基，蓝色葡聚糖2000，Trizol，氯仿，异丙醇，乙醇，乙醚，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR Premix Ex TaqTM II 等。

1.2 方法
1.2.1 鼠伤寒沙门氏菌培养实验用菌株保存在-80 ℃冻干管中。

取菌株冻干管1支，用无菌的PBS缓冲液溶解冻干的脱脂奶粉末，用接种环划线接种于LB固体培养基平板上，置于37 ℃培养箱中培养24 h后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，置于摇床中37 ℃培养过夜。

取新鲜菌液1 mL，5 000 r·min-1离心5 min后弃
去上清。

用预冷的无菌PBS重悬清洗菌体3次，最后分别用无双抗的DMEM培
养基和PBS重悬至108 CFU·mL-1待用。

1.2.2 小鼠小肠组织病理切片取10只健康活泼的Babl/c小鼠分两组饲养，每组5只。

实验组每天灌胃浓度为108 CFU·mL-1的鼠伤寒沙门氏菌100 μL，对照组每天灌胃等量的PBS缓冲液。

灌胃3 d后，取小鼠结肠进行组织病理切片分析。

1.2.3 菌体与小鼠小肠孵育将购买的Babl/c小鼠和昆明小鼠放在本实验室动物房
中适应一周后，各取10只用乙醚麻醉后处死。

对处死的小鼠进行解剖，取出小鼠小肠，截取其中3～4 cm小段，用无菌的预冷PBS清洗肠道内容物，清洗3遍。

用移液器吸取100 μL上述含终浓度为20 mg·mL-1的蓝色葡聚糖2000菌悬液灌入小肠中，封闭两段，放置到细胞培养板内，加入2 mL DMEM培养基。

将细胞
培养板放置到37 ℃，5%(v/v)CO2的细胞培养箱中，每2，4，6 h吸取细胞培养板内培养基液测定其OD630值。

以无菌体的含终浓度20 mg·mL-1蓝色葡聚糖2000的DMEM培养基作为空白对照，每组实验重复3次。

1.2.4 Caco-2细胞培养和细胞间紧密连接模型建立实验所需的Caco-2细胞保存
在液氮中，取细胞冻存管1支，复苏后接种于25 cm2细胞培养瓶中，补充DMEM完全培养基至5 mL,置于37 ℃ 、5%(v/v)CO2的细胞培养箱中培养24 h
后，显微镜下观察细胞是否贴壁。

将贴壁的细胞传代，并用细胞计数仪对测定细胞数量。

当浓度达到105 CFU·mL-1时，用移液器向每个transwell上层小室转移1 mL单细胞悬液，并放置到37 ℃、5%(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，培养期间进行换液和显微镜下观察。

21 d后，用细胞电阻仪测定跨膜电阻值，若超过200 Ω·cm2，用预冷的无菌PBS缓冲液清洗细胞单层膜，并将处理后的菌体与细胞共孵育。

用细胞电阻仪测定并记录2，4，6 h时的跨膜电阻值。

以加入无菌体的DMEM培养基作为对照，每组实验重复3次。

1.2.5 RNA提取、反转录与荧光定量采用Trizol法提取处理后Caco-2细胞总RNA，并用反转录试剂盒进行反转录[13]。

引物序列如表1所示。

使用Bio-rad CFX 96荧光定量仪进行PCR反应。

1.2.6 数据统计方法每组实验均设置3次重复，所有结果均以均值±标准差表示。

所有数据均用SPSS统计软件进行分析。

2.1 小鼠结肠组织切片
如图1所示，实验组结肠细胞出现破裂，结构完整性被破坏；正常组中细胞形态完好，结构完整，可以说明菌体对肠道有着极强的破坏能力。

2.2 小肠渗透性变化
蓝色葡聚糖2000分子量较大，且不被肠道细胞吸收，只能通过细胞间隙，当肠道屏障被破坏后，其在小肠外浓度升高。

由图2和3可以看出，菌株处理后，Babl/c和昆明小鼠肠道外蓝色葡聚糖2 000的浓度均升高，且与对照相比，均具有差异性。

结果表明鼠伤寒沙门氏菌对小鼠肠道完整性有一定的破坏。

2.3 鼠伤寒沙门氏菌对紧密连接结构的影响
在transwell的Caco-2细胞紧密连接模型中，若紧密连接结构破坏，离子流所受到的阻力减小，跨膜电阻值减小。

由图4可以看出，菌体对其破坏能力明显，跨膜电阻值下降，在2，4，6 h时与初始相比，均具有显著差异。

2.4 紧密连接蛋白相关基因表达变化
细胞间紧密连接结构受一系列蛋白的影响，包括ZO-1、Claudin-1和Occludin。

由图5可以看出，菌体处理Caco-2细胞后，与对照组相比，ZO-1下调76.7%；Claudin-1的表达下调89.3%，具有差异性(P<0.001)；Occludin的表达量也有
所下降，但没有差异性。

结果表明，鼠伤寒沙门氏菌能够使ZO-1和Claudin-1
表达下调而破坏细胞间紧密连接结构。

鼠伤寒沙门氏菌是常见的肠道致病菌，具有高致病性，其对肠上皮细胞极强的黏附能力，是其高致病性的基础[14]。

通过鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的结肠组织病理切片观察发现，肠上皮细胞破损，肠道屏障结构收到破坏。

蓝色葡聚糖2000分子量大，不被小肠细胞吸收，只能通过细胞与细胞之间的间隙通过，当肠道屏障受到破坏，细胞间间隙增大，透过屏障的蓝色葡聚糖2000的量增多，因此通过测定小肠外其浓度变化，可以反映肠道屏障受损情况[15]。

小肠受鼠伤寒沙门氏菌处理后，其外周蓝色葡聚糖2000浓度增大，表明小肠屏障被破坏。

细胞间紧密连接结构涉及许多蛋白质，其中Occlidin、Claudins和ZO家族蛋白
是其中最重要的蛋白质。

Occlidin属于Ⅱ型跨膜蛋白，参与上皮细胞间隙的封闭、调节细胞膜选择透过性和调控细胞内吞作用，Occlidin的去磷酸化等修饰能够改
变其在细胞内分布，从而不能发挥应有作用。

Claudins也是一类跨膜蛋白，是直
接构成紧密连接结构的重要蛋白质，其对紧密连接的完整性、离子的选择性透过、细胞的旁路运输和维持细胞膜之间的功能等方面有着重要的作用。

ZO蛋白家族分别有ZO-1、ZO-2和ZO-3 3种异构体，其中以ZO-1最为重要，它能将Occlidins等紧密连接相关蛋白质与与细胞肌动蛋白和激动纤维连接起来，使其与细胞骨架系统相关联，形成一个更为稳定的系统[16-17]。

对肠道细胞间紧密连接
结构的体外模型通常采用Caco-2细胞在transwell细胞小室中形成的单层膜屏障的方法，是一种成熟的体外肠道屏障模型[6]。

本实验中的结果表明鼠伤寒沙门氏
菌对紧密连接结构有较强的破坏能力，且荧光定量PCR结果表明菌体能够使紧密连接蛋白ZO-1和Claudin基因下调表达，以达到破坏紧密连接结构的目的，Occlidun的表达虽然没有显著性差异，但由于Claudins和ZO蛋白也同样是紧密连接结构的主要成分，它们的减少最终还是造成肠道机械屏障的不完整，导致肠道细胞出现破裂。

本文研究结果表明，鼠伤寒沙门氏菌通过影响ZO-1和Claudin下调表达，对细胞间紧密连接结构和肠道完整性造成破坏，补充了鼠伤寒沙门氏菌致病性机制，为进一步研究鼠伤寒沙门氏菌对肠道影响提供了理论依据。

【相关文献】
[1] THOMSON A B R,KEELAN M,THIESEN A,et al.REVIEW:Small Bowel Review:Normal Physiology Part 2[J].Digestive Diseases and Sciences,2001,46(12):2588-2607.
[2] SAADIA R,LIPMAN J.Multiple Organ Failure After Trauma[J].Bmj Clinical Research,1996,313(7057):573.
[3] 吴国豪.肠道屏障功能[J].肠外与肠内营养,2004,11(1):44-47.
[4] 尉秀清,姚集鲁,文卓夫.肠道粘膜屏障功能及其临床检测[J].国际内科学杂志,2004,31(10):415-418.
[5] FÖRSTER C.Tight Junctions and the Modulation of Barrier Function in
Disease[J].Histochemistry and Cell Biology,2008,130(1):55-70.
[6] BUCHERT M,TURKSEN K,HOLLANDE F.Methods to Examine Tight Junction Physiology in Cancer Stem Cells:TEER,Paracellular Permeability,and Dilution Potential Measurements[J].Stem Cell Reviews and Reports,2012,8(3):1030-1034.
[7] RANALDI G,CONSALVO R,SAMBUY Y,et al.Permeability Characteristics of Parental and Clonal Human Intestinal Caco-2 cell lines Differentiated in Serum-supplemented and Serum-free Media[J].Toxicology in Vitro,2003,17(6):761-767.
[8] HELMS M,ETHELBERG S,MØBAK K,et al.International Salmonella Typhimurium DT104 Infections,1992-2001.[J].Emerging Infectious Diseases,2005,11(6):859-867.
[9] MISSELWITZ B,KREIBICH S K,ROUT S,et al.Salmonella Enterica Serovar Typhimurium Binds to HeLa Cells via Fim-Mediated Reversible Adhesion and Irreversible Type Three Secretion System 1-Mediated Docking[J].Infection & Immunity Iai,2011,79(1):330-341. [10] WEENING E H,BARKER J D,LAARAKKER M C,et al.The Salmonella Enterica Serotype
Typhimurium lpf,bcf,stb,stc,std,and Sth Fimbrial Operons Are Required for Intestinal Persistence in Mice[J].Infection & Immunity,2005,73(6):3358.
[11] GALáN J E.Interactions of Salmonella with Host Cells:Encounters of the Closest Kind[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1998,95(24):14006-14008. [12] 陈晓清,焦红,程树军,等.Caco-2细胞与肠道菌共培养初建体外肠道共生模型[J].中山大学学报(医学科学版),2012,33(1):121-126.
[13] WANG B G,WU Y,QIU L,et al.Integration of Genomic and Proteomic Data to Identify Candidate Genes in HT-29 Cells After Incubation with Bifidobacterium Bifidum ATCC 29521[J].Journal of Dairy Science,2016,99(9):6874.
[14] MISSELWITZ B,KREIBICH S K,Rout S,et al.Salmonella Enterica Serovar Typhimurium Binds to HeLa Cells via Fim-Mediated Reversible Adhesion and Irreversible Type Three Secretion System 1-Mediated Docking[J].Infection & Immunity Iai,2011,79(1):330-341. [15] CAVIC M,GROZDANOVIC M M,Bajic A,et al.The Effect of Kiwifruit(Actinidia deliciosa) Cysteine Protease Actinidin on the Occludin Tight Junction Network in T84 Intestinal Epithelial Cells[J].Food & Chemical Toxicology,2014,72(2):61-68.
[16] ZHONG Y,SAITOH T,MINASE T,et al.Monoclonal Antibody 7H6 Reacts with a Novel Tight Junction-associated Protein Distinct From ZO-1,Cingulin and ZO-2[J].Journal of Cell Biology,1993,120(2):477.
[17] RYEOM S W,PAUL D,GOODENOUGH D A.Truncation Mutants of the Tight Junction Protein ZO-1 Disrupt Corneal Epithelial Cell Morphology[J].Molecular Biology of the Cell,2000,11(5):1687.。