高效液相色谱法测定植物果实中儿茶素、表儿茶素和原花青素B2

高效液相色谱法测定植物果实中儿茶素、表儿茶素和原花青素
B2
胡凤;娄大伟;祝波;连丽丽;任红;金丽;陈晓影;杨巧玲
【摘要】提出了高效液相色谱法测定植物果实中儿茶素、表儿茶素和原花青素B2.样品经乙醇(6+4)溶液索氏提取后,用固相萃取技术对提取液进行净化.以SinoChrom ODS C18色谱柱为分离柱,以乙腈-0.1％((φ))磷酸溶液(15+85)为流
动相进行洗脱,检测波长为280 nm.3种目标分析物质量浓度的线性范围为5.0～100.0 mg·L-1,方法的检出限(3S/N)在1.03～2.38 mg·L-1之间.对样品进行加标回收试验,回收率在83.6％～98.5％之间,测定值的相对标准偏差(n=3)在0.4％～2.1％之间.
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2015(051)004
【总页数】4页(P489-492)
【关键词】高效液相色谱法;儿茶素;表儿茶素;原花青素B2
【作者】胡凤;娄大伟;祝波;连丽丽;任红;金丽;陈晓影;杨巧玲
【作者单位】吉林化工学院化学系,吉林132022;东北师范大学化学学院,长春130024;吉林化工学院化学系,吉林132022;吉林化工学院化学系,吉林132022;吉
林化工学院化学系,吉林132022;吉林大学化学学院,长春130012;吉林化工学院化
学系,吉林132022;吉林化工学院化学系,吉林132022;吉林化工学院化学系,吉林
132022;吉林大学化学学院,长春130012;吉林化工学院化学系,吉林132022;东北师范大学化学学院,长春130024
【正文语种】中文
【中图分类】O657.7
原花青素(OPC)是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物,它是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成,最简单的原花青素是儿茶素或表儿茶素自身缩合或儿茶素与表儿茶素共同形成的二聚体[1]。

原花青素具有多种药理活性,是一种天然的自由基清除剂和抗氧化剂,具有抗衰老、抗肿瘤、抗癌变,预防心脑血管疾病,预防动脉粥样硬化等功能[2-3]。

原花青素已广泛应用于食品、药品和化妆品等领域。

原花青素的测定常采用分光光度法、薄层扫描法、毛细管电泳法、库仑滴定法和高效液相色谱法(HPLC)[4]等。

目前,提取原花青素的方法有溶剂提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法、超声波提取法及酶法提取法等[5-6]。

有关儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取方法有红外辅助萃取法、微波辅助提取法和超声波提取法等[7],而对于索氏提取法提取儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的研究未见报道。

本工作用索氏提取法提取葡萄籽、橡子和石榴籽中的儿茶素、表儿茶素和原花青素B2,采用高效液相色谱法对其含量进行测定。

1 试验部分
1．1 仪器与试剂
LC-20型高效液相色谱仪,配SPD-20A型紫外-可见检测器;SE-412型索氏抽提器;RT 1045N8616型SPE固相萃取仪;微量进样器;0.45 μm微孔过滤膜。

儿茶素、表儿茶素、原花青素B2标准储备溶液:100.0 mg·L-1,分别称取儿茶素、
表儿茶素、原花青素B2标准对照品各0.005 0 g,用甲醇溶解稀释至50 mL。

甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯,乙醇为分析纯,试验用水为高纯水。

1．2 色谱分析条件
SinoChrom ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.1%(体积分数,下同)磷酸(15+85)溶液,流量为1.00 mL·min-1,检测波长为280 nm,柱温为25 ℃,进样量为10 μL,等度洗脱。

1．3 试验方法
称取葡萄籽粉、橡子粉和石榴籽粉各2.000 0 g于纸套筒内,向提取杯内加入乙醇(6+4)溶液120 mL,在70 ℃下提取40 min,再将提取液放入50 ℃水浴中加热30 min,冷却后离心,取上清液10 mL吹干,用5 mL水溶解,得样品溶液。

将样品溶液置于固相萃取仪内,以0.1 mL·min-1速率用水淋洗2次,再用甲醇(20+80)溶液淋洗1次,每次5 mL。

加入甲醇1 mL,收集洗脱液,即制得待测溶液,将待测溶液,用0.45 μm微孔过滤膜过滤,按高效液相色谱条件分析。

2 结果与讨论
2．1 流动相配比的选择
试验采用等度洗脱条件。

以不同体积比的乙腈-0.1%磷酸作为流动相时,混合标准溶液的分离效果见图1。

(a) 乙腈-0.1%磷酸(20+80)溶液
(b) 乙腈-0.1%磷酸(15+85)溶液
(c) 乙腈-0.1%磷酸(10+90)溶液 1-儿茶素;2-原花青素B2;3-表儿茶素图1 不同流动相组成条件下儿茶素、表儿茶素和原花青素B2混合标准溶液的色谱图Fig. 1 Chromatograms of the mixed standard solution of catechin, epicatechin and procyanidin B2 in the mobile phases with different compositions
由图1可知:降低流动相中水相的比例有助于目标物较早出峰,缩短出峰时间,同时获
得较好的峰形和较高的峰高,但不利于表儿茶素与原花青素B2的分离(图1a)。

提高水相比例,可以获得良好的分离度,但易使表儿茶素的峰形变差,信号削减严重(图1c)。

经过对比,流动相为乙腈-0.1%磷酸(15+85)时可以使目标物在15 min内达到满意分离,且色谱峰形良好,信号强度适当。

2．2 提取条件的选择
2．2．1 提取剂的浓度
试验考察了乙醇溶液体积分数分别为0,20%,40%,60%,80%,100%时对儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取效果。

结果表明:随乙醇用量增加,目标分析物的提取量增大,当乙醇用量增加到一定时,目标分析物的提取量达到最大;继续增大乙醇用量,目标分析物的提取量下降。

原因可能是儿茶素、表儿茶素和原花青素B2属多酚类化合物,含有大量的羟基,具有一定的极性,根据相似相溶原理,当提取剂的极性与其相当时,其溶解度最大,提取量最高;继续增大乙醇用量,使得极性差距增大,溶解度降低,提取量下降。

试验选择乙醇的体积分数为60%。

2．2．2 提取时间
试验考察了提取时间分别为20,30,40,50,60,80 min时对儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取效果。

结果表明:随着提取时间的延长,儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取量增加。

到达一定时间后,目标分析物的提取量达到最大,随时间的延长,提取量有减少的趋势,可能由于长时间加热,目标分析物被破坏。

试验选择提取时间为40 min。

2．2．3 提取温度
试验考察了提取温度在50 ℃～100 ℃时对儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取效果。

结果表明:提取温度对目标分析物的提取率影响较大,随提取温度的升高,3种目标分析物的提取量都明显增大,当温度达70 ℃时,提取量最大,之后继续升高温度,目标分析物的提取量呈现明显下降趋势。

温度升高超出某一界限可能会造成目
标分析物结构的破坏,使其有效成分含量降低。

试验选择提取温度为70 ℃。

2．2．4 料液比
试验考察了料液比(g/mL)为1比30,1比40,1比50,1比60,1比70,1比80时提取效果。

结果表明:随溶剂量的增加,目标分析物的提取量明显增大,当溶剂量达到一定量时,目标分析物的提取量达到最大限度,1比60为合适的料液比。

样品溶液和标准溶液的色谱图见图2(a～d)。

(a) 混合标准溶液 (b) 葡萄籽样品溶液
(c) 石榴籽样品溶液 (d) 橡子样品溶液 1-儿茶素;2-原花青素B2;3-表儿茶素图2 色谱图Fig. 2 Chromatograms
2．3 标准曲线和检出限
移取适量的混合标准储备溶液,用甲醇稀释至5 mL,摇匀,经0.45 μm微孔过滤膜过滤,按色谱条件进行测定,以化合物的质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表1,选取葡萄籽样品进行测定,以3倍信噪比计算方法的检出限见表1。

表1 线性参数和检出限Tab. 1 Linearity parameters and detection limits分析物线性范围ρ/(mg·L-1)线性回归方程相关系数检出限ρ/(mg·L-1)儿茶素5.0～100.0y=4196.9x+10286.60.99692.34表儿茶素5.0～100.0y=5059.6x-3954.90.99951.03原花青素B25.0～100.0y=4940.0x-15235.90.99952.38 2．4 样品分析
按试验方法对葡萄籽、橡子、石榴籽等样品进行分析,重复测定3次。

3种植物果实中,葡萄籽中的表儿茶素和原花青素B2含量最高,分别为21.88 mg·g-1和3.14 mg·g-1;石榴籽中的儿茶素含量最高,为10.86 mg·g-1。

称取空白样品1.000 0 g,加入儿茶素、表儿茶、原花青素B2标准品各2.0 mg进行回收试验,对同一样品分别取3份进行精密度试验,结果见表2。

表2 方法的回收率和精密度(n=3)Tab. 2 Recovery and precision of the method化合物葡萄籽橡子石榴籽回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率
/%RSD/%儿茶素89.40.990.61.396.20.4表儿茶素98.51.192.11.594.80.8原花青素B291.70.783.62.188.01.0
由表2可知:方法的回收率在83.6%～98.5%之间,测定值的相对标准偏差(n=3)为0.4%～2.1%,说明本法具有良好的准确性和重复性。

HPLC Determination of Catechin, Epicatechin and Procyanidin B2 in Plant Fruits
HU Feng1,2, LOU Da-wei1,*, ZHU Bo1, LIAN Li-li1,3, REN Hong1,JIN Li1, CHEN Xiao-ying1,3, YANG Qiao-ling1,2
(1. Department of Chemistry, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China;2. College of Chemistry, Northeast Normal University, Changchun 130024, China;3. College of Chemistry, Jilin University, Changchun 130012, China)
Abstract：HPLC was applied for the determination of catechin, epicatechin and procyanidin B2 in plant fruits. The sample was extracted with ethanol solution (6+4) by soxhlet extraction. The extract was purified by solid phase extraction and then was separated on a SinoChrom ODS C18 column with a mixture of acetonitrile and 0.1% (φ) phosphoric acid solution as mobile phase. UV absorbance was measured at 280 nm. The linearity range of the mass concentration of the 3 target analytes was 5.0-100.0 mg·L-1, with detection limits (3S/N) in the range of 1.03-2.38 mg·L-1. The recovery rates measured by standard addition method were in the
range of 83.6%-98.5% with RSD (n=3) in the range of 0.4%-2.1%. Keywords：HPLC; Catechin; Epicatechin; Procyanidin B2
收稿日期：2014-03-25
基金项目：国家自然科学基金(201375046);吉林省科技发展计划项目(20130521024JH;2013C041);吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2013313)
作者简介：胡凤(1986-),女,黑龙江巴彦人,硕士研究生,主要从事现代分离方法的研究。

* 联系人。

E-mail:*****************
中图分类号：O657.7
文献标志码：A
文章编号：1001-4020(2015)04-0489-04
原花青素(OPC)是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物,它是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成,最简单的原花青素是儿茶素或表儿茶素自身缩合或儿茶素与表儿茶素共同形成的二聚体[1]。

原花青素具有多种药理活性,是一种天然的自由基清除剂和抗氧化剂,具有抗衰老、抗肿瘤、抗癌变,预防心脑血管疾病,预防动脉粥样硬化等功能[2-3]。

原花青素已广泛应用于食品、药品和化妆品等领域。

原花青素的测定常采用分光光度法、薄层扫描法、毛细管电泳法、库仑滴定法和高效液相色谱法(HPLC)[4]等。

目前,提取原花青素的方法有溶剂提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法、超声波提取法及酶法提取法等[5-6]。

有关儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取方法有红外辅助萃取法、微波辅助提取法和超声波提取法等[7],而对于索氏提取法提取儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的研究未见报道。

本工作用索氏提取法提取葡萄籽、橡子和石榴籽中的儿茶素、表儿茶素和原花
青素B2,采用高效液相色谱法对其含量进行测定。

1．1 仪器与试剂
LC-20型高效液相色谱仪,配SPD-20A型紫外-可见检测器;SE-412型索氏抽提器;RT 1045N8616型SPE固相萃取仪;微量进样器;0.45 μm微孔过滤膜。

儿茶素、表儿茶素、原花青素B2标准储备溶液:100.0 mg·L-1,分别称取儿茶素、表儿茶素、原花青素B2标准对照品各0.005 0 g,用甲醇溶解稀释至50 mL。

甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯,乙醇为分析纯,试验用水为高纯水。

1．2 色谱分析条件
SinoChrom ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.1%(体积分数,下同)磷酸(15+85)溶液,流量为1.00 mL·min-1,检测波长为280 nm,柱温为25 ℃,进样量为10 μL,等度洗脱。

1．3 试验方法
称取葡萄籽粉、橡子粉和石榴籽粉各2.000 0 g于纸套筒内,向提取杯内加入乙醇(6+4)溶液120 mL,在70 ℃下提取40 min,再将提取液放入50 ℃水浴中加热30 min,冷却后离心,取上清液10 mL吹干,用5 mL水溶解,得样品溶液。

将样品溶液置于固相萃取仪内,以0.1 mL·min-1速率用水淋洗2次,再用甲醇(20+80)溶液淋洗1次,每次5 mL。

加入甲醇1 mL,收集洗脱液,即制得待测溶液,将待测溶液,用0.45 μm微孔过滤膜过滤,按高效液相色谱条件分析。

2．1 流动相配比的选择
试验采用等度洗脱条件。

以不同体积比的乙腈-0.1%磷酸作为流动相时,混合标准溶液的分离效果见图1。

由图1可知:降低流动相中水相的比例有助于目标物较早出峰,缩短出峰时间,同时获得较好的峰形和较高的峰高,但不利于表儿茶素与原花青素B2的分离(图1a)。

提高水相比例,可以获得良好的分离度,但易使表儿茶素的峰形变差,信号削减严重(图
1c)。

经过对比,流动相为乙腈-0.1%磷酸(15+85)时可以使目标物在15 min内达到满意分离,且色谱峰形良好,信号强度适当。

2．2 提取条件的选择
2．2．1 提取剂的浓度
试验考察了乙醇溶液体积分数分别为0,20%,40%,60%,80%,100%时对儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取效果。

结果表明:随乙醇用量增加,目标分析物的提取量增大,当乙醇用量增加到一定时,目标分析物的提取量达到最大;继续增大乙醇用量,目标分析物的提取量下降。

原因可能是儿茶素、表儿茶素和原花青素B2属多酚类化合物,含有大量的羟基,具有一定的极性,根据相似相溶原理,当提取剂的极性与其相当时,其溶解度最大,提取量最高;继续增大乙醇用量,使得极性差距增大,溶解度降低,提取量下降。

试验选择乙醇的体积分数为60%。

2．2．2 提取时间
试验考察了提取时间分别为20,30,40,50,60,80 min时对儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取效果。

结果表明:随着提取时间的延长,儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取量增加。

到达一定时间后,目标分析物的提取量达到最大,随时间的延长,提取量有减少的趋势,可能由于长时间加热,目标分析物被破坏。

试验选择提取时间为40 min。

2．2．3 提取温度
试验考察了提取温度在50 ℃～100 ℃时对儿茶素、表儿茶素和原花青素B2的提取效果。

结果表明:提取温度对目标分析物的提取率影响较大,随提取温度的升高,3种目标分析物的提取量都明显增大,当温度达70 ℃时,提取量最大,之后继续升高温度,目标分析物的提取量呈现明显下降趋势。

温度升高超出某一界限可能会造成目标分析物结构的破坏,使其有效成分含量降低。

试验选择提取温度为70 ℃。

2．2．4 料液比
试验考察了料液比(g/mL)为1比30,1比40,1比50,1比60,1比70,1比80时提取效果。

结果表明:随溶剂量的增加,目标分析物的提取量明显增大,当溶剂量达到一定量时,目标分析物的提取量达到最大限度,1比60为合适的料液比。

样品溶液和标准溶液的色谱图见图2(a～d)。

2．3 标准曲线和检出限
移取适量的混合标准储备溶液,用甲醇稀释至5 mL,摇匀,经0.45 μm微孔过滤膜过滤,按色谱条件进行测定,以化合物的质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表1,选取葡萄籽样品进行测定,以3倍信噪比计算方法的检出限见表1。

2．4 样品分析
按试验方法对葡萄籽、橡子、石榴籽等样品进行分析,重复测定3次。

3种植物果实中,葡萄籽中的表儿茶素和原花青素B2含量最高,分别为21.88 mg·g-1和3.14 mg·g-1;石榴籽中的儿茶素含量最高,为10.86 mg·g-1。

称取空白样品1.000 0 g,加入儿茶素、表儿茶、原花青素B2标准品各2.0 mg进行回收试验,对同一样品分别取3份进行精密度试验,结果见表2。

由表2可知:方法的回收率在83.6%～98.5%之间,测定值的相对标准偏差(n=3)为0.4%～2.1%,说明本法具有良好的准确性和重复性。

* 联系人。

E-mail:*****************
【相关文献】
[1] 张妍,吴秀香.原花青素研究进展[J].中药药理与临床, 2011,27(6):112-116．
[2] SHARMA S D, KATIYAR S K. Dietary grape-seed proanthocyanidin inhibition of ultraviolet B-induced immune suppression is associated with induction of IL-12[J]. Carcinogenesis, 2006,27(1):95-102．
[3] PELLATI F, PRENCIPE F P, BERTELLI D, et al. An efficient chemical analysis of phenolic
acids and flavonoids in raw propolis by microwave-assisted extraction combined with
high-performance liquid chromatography using the fused-core technology[J]. J Pharm Biomed Anal, 2013,81-82:126-132．
[4] 刘刚,谭生建,姜韧,等.高效液相色谱法测定茶黄酊中儿茶素和表儿茶素的含量[J].解放军药学学报, 2008,24(4):363-364．
[5] 陆敏,张文娜.银杏叶中黄酮类化合物的提取、纯化及测定方法的研究进展[J].理化检验-化学分册, 2012,48(2):616-620．
[6] WANG Gui-hua, SU Ping, ZHANG Fan, et al. Comparison of microwave-assisted extraction of aloe-emodin in aloe with Soxhlet extraction and ultrasound-assisted extraction[J]. Sci China Chem, 2011,54(1):231-236．
[7] CAI Yi, YU Ying-jia, DUAN Geng-Li, et al. Study on infrared-assisted extraction coupled with high performance liquid chromatography (HPLC) for determination of catechin, epicatechin, and procyanidin B2 in grape seeds[J]. Food Chemistry, 2011,127(4):1872-1877．。