外源性硫化氢抑制ox-LDL诱导血管内皮细胞组织因子的表达与降低ROS产生和抑制NF-κB活化有关

外源性硫化氢抑制ox-LDL诱导血管内皮细胞组织因子的表达与降低ROS产生和抑制NF-κB活化有关
邓华菲;任重;唐伟军;李雪飞;谭玉林;唐志晗;刘录山;王佐;姜志胜
【摘要】目的：探讨外源性硫化氢抑制氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导内皮细胞组织因子（TF）表达的机制。

方法分别用不同浓度NaHS（25、50、100和200μmol·L－1）和50 mg·L－1 ox-LDL孵育人脐静脉内皮细胞（HUVECs），用RT-PCR 和ELISA 法检测HUVECs TF mRNA 表达和蛋白含量，DCFH 法测细胞
内活性氧（ROS）的含量，Western blot 测核蛋白转录因子（NFκB）的活化。

结果 ox LDL 明显诱导HU VECs TF mRNA 的表达和蛋白含量增加；细胞内ROS 水平升高，NFκB 活化。

NaHS 明显抑制了ox LDL 对TF mRNA 和蛋白表达的诱导作用，同时降低ox LDL 诱导的细胞内ROS生成和NFκB 活化。

此外，NFκB 抑制剂BAY 117082（10μmol·L －1 ）或抗氧化剂N乙酰半
胱氨酸（1 mmol·L －1 ）也能抑制ox LDL 诱导TF mRNA 表达和蛋白含量的
增加，同时降低细胞内ROS 生成和NFκB 活化，该作用与200 μmol·L －1 NaHS 的效应相似。

结论 NaHS 抑制ox LDL 诱导内皮细胞TF 的表达与降低ROS 产生和抑制NFκB 活化有关。

%Aim To investigate the mechanism for the inhibitory effect of hydrogen sulfide on the expression of tissue
factor(TF)induced by oxidative low-density lipoprotein(ox-LDL)in endothelial cells.Methods Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs ) were treated with 50 mg·L-1 ox-LDL in the absence or presence of different concentrations of NaHS (25 , 50,100 and 200 μmol·L-1 )for 24 h.The mRNA expression and protein content of TF in HUVECs were determined by reverse transcription PCR and ELISA, respectively.The content of
intracellular reactive oxy-gen species (ROS)was determined by DCFH,an oxi-dative sensitive fluorescent indicator.The activation of nuclear factor-kappaB (NF-κB)was estimated by its expression in nuclear extracts analyzed by Western blot.Results Ox-LDL induced TF mRNA expression and increased TF protein content in HUVECs.The in-crease in intracellular ROS production and the activa-tion of NF-κB were observed in HUVECs treated with ox-LDL.However,NaHS could markedly inhibit the increases in TF mRNA and protein levels induced by ox-LDL.Also the elevation of intracellular ROS pro-duction and the activation of NF-κB elicited by ox-LDL were significantly suppressed by pretreatment with NaHS.In addition,pretreatment with BAY 1 1-7082 (10 μmol·L-1 ),the inhibitor of NF-κB or N-acetyl-L-cysteine(1 mmol·L-1 ),an antioxidant,could also decrease the TF mRNA and protein level as well as ROS production and NF-κB activation induced by ox-LDL in HUVECs,similar to the effects of 200 μmol· L-1 NaHS.Conclusion The mechanism for the in-hibitory effect of H2 S on the ox-LDL- induced TF ex-pression in endothelial cells may be related to inhibi-ting intracellular ROS production and subsequently NF-κB activation.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2014(000)007
【总页数】6页(P979-984)
【关键词】硫化氢;氧化型低密度脂蛋白;组织因子;NF-κB;活性氧;内皮细胞;血管
【作者】邓华菲;任重;唐伟军;李雪飞;谭玉林;唐志晗;刘录山;王佐;姜志胜
【作者单位】湘南学院病理生理学教研室，湖南郴州 423000; 南华大学心血管病研究所，湖南衡阳 421001;南华大学心血管病研究所，湖南衡阳 421001;湘南学院病理生理学教研室，湖南郴州 423000;湘南学院病理生理学教研室，湖南郴州423000;湘南学院病理生理学教研室，湖南郴州 423000;南华大学心血管病研究所，湖南衡阳 421001;南华大学心血管病研究所，湖南衡阳 421001;南华大学心血管病研究所，湖南衡阳 421001;南华大学心血管病研究所，湖南衡阳 421001【正文语种】中文
【中图分类】R322.12;R329.24;R341.35;R543.502.2;R977.6
急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是心血管疾病患者死亡的重要原因之一，而动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）斑块破裂及随后的血栓形成是ACS发生的病理基础。

组织因子（tissue factor，TF）即凝血因子Ⅲ，是凝血因子Ⅶ的辅因子和受体，是启动外源性及内源性凝血过程的重要因子。

研究显示，ACS患者血浆中TF抗原水平及其活性明显高于稳定性心绞痛患者和正常人，血浆TF水平是ACS患者预后的重要预测指标［1］。

正常状态下内皮细胞并不表达TF，但能被多种As危险因素，如氧化型低密度脂蛋白（oxidative low-density lipoprotein，ox-LDL）诱导表达［2］。

既然 TF与 ACS的发生发展密切相关，抑制TF的产生可能是阻止ACS发生发展的有效途径。

硫化氢（hydrogen sulfide，H2 S）是继 NO和 CO之后的又一气体信号分子。

与NO和CO相似，H2 S具有调节血压［3］、抑制血管平滑肌细胞增殖［4］、降低脂质过氧化［5］等心血管药理作用。

临床研究发现H2 S水平降低与冠心病
的病情、冠脉血管病变、冠心病危险因素等密切相关［6］。

内源性H2 S产生减
少加速了As的发生发展［7］，而应用外源性H2 S可以延缓ApoE基因敲除小
鼠As的进程［8］。

最近我们发现，外源性H2 S能抑制ox-LDL诱导内皮细胞凋亡和巨噬细胞内脂质蓄积［9－10］。

本室前期工作表明H2 S可明显降低ox-LDL诱导内皮细胞TF表达［2］。

本实验探讨外源性H2 S抑制ox-LDL诱导内皮细胞TF表达的机制，为H2 S用于临床防治心脑血管血栓性疾病提供理论及实验
依据。

1 材料与方法
1.1 主要试剂和材料 NaHS（H2 S供体）购自Sigma公司，ox-LDL购自广州奕
源生物科技有限公司，TF和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成，
RT-PCR试剂盒购自Promega公司，Taq PCR MasterMix和DNA marker购自北京天根公司。

TF ELISA试剂盒购自美国RD公司。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）购自美国Amresco公司，BAY 11-7082，NF-κB p65抗体、组蛋白 H3（Histone H3）抗体、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检
测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天有限责任公司。

1.2 细胞培养及分组 HUVEC-12购自中南大学湘雅医学院实验中心，用含10%胎牛血清DMEM培养液培养，2～3 d更换培养液并传代。

选择对数生长期细胞用
于实验，实验前24 h换无血清培养液进行同步化后分组处理。

①正常对照组：DMEM培养液培养24 h；②ox-LDL组：含50 mg·L－1 ox-LDL的DMEM培养液培养24 h；③ox-LDL＋NaHS处理组：分别经 25、50、100及200μmol·L－
1 NaHS培养 1 h，再与50 mg·L－1 ox-LDL共同培养24 h；④NF-κB抑制剂组：经10μmol·L－1 BAY 11-7082预孵育1 h，再与50mg·L－1 ox-LDL共同培养
24 h；⑤抗氧化剂组：经1 mmol·L－1 NAC预孵育 1 h，再与50 mg·L－1 ox-LDL共同培养24 h。

1．3 RT-PCR法检测TF m RNA表达收集内皮细胞，用TRIzol提取细胞总RNA 并融于无RNase水中，分别取0.2μg RNA用M-MuLV反转录酶合成cDNA。

人TF引物序列上游为5′-AGAGGATAGAATACATGGAAACGC-3′，下游为5′-CTAAAGCATGTTATGTGCAAAAGG-3′，产物长度 210 bp。

PCR反应条件为94℃预变性4 min，94℃变性30 s，56.5℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 32
个循环，72℃继续延伸10 min。

内参GAPDH引物序列上游为5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，下游为5′-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′，产物长度 697 bp。

反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共26个循环，72℃继续延伸5 min。

用1.5%的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，拍照电泳条带并分析。

每组实验重复3次。

1．4 ELISA检测TF蛋白含量在37℃与－80℃间反复冻融细胞3次以获取细胞冻融液检测TF蛋白含量。

采用双夹心ELISA法测定TF蛋白，将被测蛋白结合在吸
附于固体测定板上的多克隆抗体，然后加入酶连接的单克隆抗体，该抗体与已被多克隆抗体结合的蛋白结合，再加入发色底物，于15 min内用酶标仪测定各管吸光度（OD值）。

以不同浓度TF标准品为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准
品线性回归曲线，按曲线方程计算各种样品的浓度。

1．5 DCFH荧光分光光度法检测细胞内ROS含量
DCFH-DA本身没有荧光，能自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，后者不能通过细胞膜。

细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光可以反映细胞内活性氧的水平。

接种于12孔培养板上的细胞经各因素干预后，用0.1 mol·L－1的PBS（pH＝7.4）洗3次，然后经0.25%的胰蛋白酶消化，无血清DMEM吹打，制成单细胞悬液，1 000 r·min－1，离心5 min，弃上清，再用无血清 DMEM洗1次后弃上清，用稀释好的DCFH-DA重悬细胞（终浓度为10μmol·L－1），37℃孵育 20 min后用
无血清的DMEM洗3次，去掉未进入细胞内的DCFHDA，30 min后用荧光分光光度计检测其荧光强度（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

1．6 核蛋白的提取和NF-κB活化的检测在冰上进行核蛋白的提取，BCA法定量
蛋白浓度。

配制10%SDS-PAGE分离胶和5%积层胶，蛋白样品加入到5×SDS凝胶上样缓冲液中，在沸水中煮5 min使蛋白变性，然后每孔加入20μg核蛋白，10%SDSPAGE电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶的TBST室
温下封闭2 h，再分别与NF-κB，p65抗体（稀释浓度为1∶300）或组蛋白H3
抗体（稀释浓度为1∶500）4℃孵育12 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释浓度为1∶1 000）室温孵育2 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，加发光剂显影、定影、洗片后进行图像分析，结果用灰度比
值表示。

1.7 统计学分析所有数据用±s表示。

SPSS 19.0进行统计处理，组间比较采用方
差分析及t检验。

2 结果
2．1 NaHS对 ox-LDL诱导TF m RNA表达和蛋白含量的影响与正常对照组相比，50 mg·L－1 ox-LDL明显增加了HUVECs TF mRNA的表达和蛋白含量，分别增
加了8倍和7倍；不同浓度NaHS明显抑制了ox-LDL对HUVECs中TFmRNA
和蛋白表达的诱导作用，分别抑制了12%、31%、64%、82%和13%、32%、62%、78%（Fig 1、2）。

Fig 1 Effects of different concentrations of NaHS on expression of HUVECs TF mRNA induced by ox-LDL（±s，n＝3）1：Represents control group；2：Represents ox-LDL group；3：Represents ox-LDL＋25μmol·L－1 NaHS group；4：Represents ox-LDL＋50μmol·L－1 NaHS group；5：Represents ox-LDL＋100μmol·L－1 NaHS group；6：Represents ox-LDL ＋200μmol·L－
1 NaHS group；**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group.
Fig 2 Effects of different concentrations of NaHS on concentrations of HUVECs TF protein induced by ox-LDL（±s，n＝3）1：Represents control group；2：Representsox-LDL group；3：Represents ox-LDL＋25μmol·L－1 NaHS group；4：Represents ox-LDL＋50 μmol·L－1 NaHSgroup；5：Represents ox-LDL＋100μmol·L－1 NaHS group；6：Represents ox-LDL＋200μmol·L－1 NaHS group.**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group.
2．2 Bay11-7082和NAC对ox-LDL诱导TF m RNA表达和蛋白含量的影响NF-κB的抑制剂——Bay11-7082预孵育HUVECs 1 h，明显抑制ox-LDL诱导的TFmRNA表达和蛋白含量的增加，分别抑制了83%和79%；抗氧化剂——NAC也能明显抑制ox-LDL诱导HUVECs TFmRNA表达和蛋白含量的增加，分别抑制了75%和76%，两者的抑制效应与200μmol·L－1 NaHS的抑制效果相似（Fig 3、4）。

Fig 3 Effects of Bay11-7082，NAC and 200μmol·L－1 NaHS on expression of HUVECs TFm RNA induced by ox-LDL（±s，n＝3）1：Represents control group；2：Represents ox-LDL group；3：Represents ox-LDL＋
10μmol·L－1 Bay11-7082 group；4：Represents ox-LDL＋1 mmol·L－1 NAC group；5：Represents ox-LDL＋200μmol·L－1 NaHS group.**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group.
Fig 4 Effects of Bay11-7082，NAC and 200μmol·L－1 NaHS on content of TF protein in HUVECs induced by ox-LDL（±s，n＝3）1：Represents control group；2：Represents ox-LDL group；3：Represents ox-LDL＋
10μmol·L－1 Bay11-7082 group；4：Represents ox-LDL＋1 mmol·L－1 NAC group；5：Represents ox-LDL＋200μmol·L－1 NaHS group.**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group.
2．3 NaHS、Bay11-7082和 NAC对 ox-LDL诱导细胞内ROS产生的作用 50 mg·L－1 ox-LDL孵育内皮细胞24 h可以明显增加细胞内ROS水平，而不同浓度NaHS预处理可明显抑制ox-LDL诱导的细胞内ROS的增加，分别降低7%、21%、38%和55%（Fig 5）。

NF-κB抑制剂 Bay11-7082和抗氧化剂NAC也明显降低ox-LDL诱导的细胞内ROS含量增加，分别降低57%和57%，它们对ox-LDL诱导ROS产生的抑制效应与200μmol·L－1 NaHS的抑制效应相似。

Fig 5 Effects of different concentrations of NaHS，Bay11-7082 and NAC on ox-LDL-induced ROS content in HUVECs（±s，n＝3）1：Represents control group；2：Represents ox-LDL group；3：Represents ox-LDL＋
25μmol·L－1 NaHS group；4：Represents ox-LDL＋50μmol·L－1 NaHS group；5：Represents ox-LDL＋100μmol·L－1 NaHS group；6：Represents ox-LDL ＋200μmol·L－1 NaHS group；7：Represents ox-LDL＋10μmol·L－1 Bay11-7082 group；8：Represents ox-LDL＋1 mmol·L－1 NAC group.**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group. 2．4 NaHS、Bay11-7082和 NAC对 ox-LDL诱导内皮细胞内NF-κB活化的影响与正常对照组比，50 mg·L－1 ox-LDL孵育内皮细胞24 h使核内NF-κB p65的表达明显增加，而不同浓度NaHS预处理可明显抑制ox-LDL诱导核内NF-κB p65表达，分别抑制了 10%，25%，39% 和 57% （Fig 6）。

NF-κB抑制剂Bay11-7082和抗氧化剂NAC也明显抑制了ox-LDL诱导细胞内 NF-κB p65表达，分别抑制了55%和55%，其效应与200μmol·L－1 NaHS的抑制效应相似。

Fig 6 Effects of different concentrations of NaHS，Bay11-7082 and NAC on
NF-κB activat ion induced by ox-LDL in HUVECs（±s，n＝3）1：Represents control group；2：Represents ox-LDL group；3：Represents ox-LDL＋
25μmol·L－1 NaHS group；4：Represents ox-LDL＋50μmol·L－1 NaHS group；5：Represents ox-LDL＋100μmol·L－1 NaHS group；6：Represents ox-LDL ＋200μmol·L－1 NaHS group；7：Represents ox-LDL＋10μmol·L－1 Bay11-7082 group；8：Represents ox-LDL＋1 mmol·L－1 NAC group.**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group.
3 讨论
冠状As斑块溃疡、破裂基础上的血栓形成是ACS的重要发病机制。

TF是凝血瀑布的主要启动因素，在动脉血栓形成中起关键作用。

生理情况下，内皮细胞不表达TF，内膜中也检测不到TF抗原和mRNA，当内皮功能受损及某些病理情况下内皮细胞可产生大量TF。

被释放的TF进入血液循环后与FⅦa形成复合物，激活凝血酶原和纤维蛋白原，从而促进血栓形成。

高脂血症是As的重要危险因素之一，其中低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）水平升高是高脂血症诱导内皮激活和损伤的主要因素。

LDL 发生氧化修饰形成ox-LDL后具有更强的损伤血管的能力，它施加了种种促As的作用，如促进血管平滑肌细胞增殖、诱导泡沫细胞形成，并作用于血管内皮，导致局部凝血功能紊乱。

大量的ox-LDL蓄积于As斑块中时导致TF在破裂的斑块中表达明显增加，可见ox-LDL与As血栓密切相关。

事实上，有研究报道ox-LDL 能诱导培养的人脐静脉内皮细胞TF表达增强［11］，本研究也得到相似的结果，50 mg·L－1 ox-LDL明显增加了HUVECs TF mRNA的表达和蛋白含量，因此，ox-LDL具有促进血栓形成的作用。

ox-LDL诱导TF表达的机制尚不完全清楚，有研究报道ox-LDL通过氧化应激导致内皮细胞损伤［11］，而氧化应激在NF-κB
的活化过程中起着非常重要的作用，NF-κB的活化诱导了 TF的生成［12］。

我们研究发现ox-LDL增加TF mRNA和蛋白表达，伴随ROS产生的增多，而抗氧化剂NAC明显降低ox-LDL诱导的TF mRNA和蛋白表达，同时减少ROS的产生；本研究还显示ox-LDL增加TF mRNA和蛋白表达的同时，伴随 NF-κB的活化，而 NF-κB的抑制剂BAY 11-7082明显抑制了NF-κB的活化，同时降低了TFmRNA和蛋白表达，这些结果表明，ox-LDL通过ROS-NF-κB途径诱导TF的表达。

既然ox-LDL诱导ROS的产生，进而使NF-κB活化，导致了TF表达的增多，并最终促进血栓的形成。

因此，清除 ROS，抑制 NF-κB的活化，降低 TF的表达，对于控制As和其他心脑血管疾病具有重要意义。

大量研究表明，H2 S具有重要的调节心血管系统的生理和药理作用［3－5］。

本室研究发现，外源性H2 S能抑制ox-LDL诱导内皮细胞TF表达［2］，但H2 S对TF的作用机制尚不明了。

最近有研究报道H2 S是一种ROS的内源性清除剂。

Muzaffar等［13］报道H S 抑制TNF-α诱导的猪肺动脉内皮细胞产生。

我们以前研究发现H2 S抑制ox-LDL 诱导的内皮细胞凋亡和巨噬细胞泡沫化，其机制与降低ROS的产生有关［9－10］。

与这些结果一致，本实验也发现NaHS降低了ox-LDL诱导的内皮细胞ROS的产生。

而且200μmol·L－1 NaHS明显抑制ox-LDL诱导的TFmRNA和蛋白表达，其效应与抗氧化剂1 mmol·L－1 NAC相似。

NF-κB是以p50/p65异二聚体形式存在于细胞质中的快反应转录因子，与NF-κB的抑制性蛋白（inhibitor kappaB，IκB）结合而呈非活性状态。

当细胞受刺激后，IκB磷酸化并降解，NF-κB游离并迅速转移到细胞核内，诱导相关基因转录。

通过免疫染色检测NF-κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内，就可以判断NF-κB是否被激活。

本实验发现，预先用NaHS孵育能明显抑制ox-LDL诱导内皮细胞NF-κB p65核转位，200μmol·L－1 NaHS的作用效果与10μmol·L－1 NF-κB抑制剂 BAY 11-7082
相似。

Wang等［14］研究发现NaHS抑制TNF-α诱导的IκB的降解和NF-κB 核转位；NaHS处理自发性高血压大鼠明显降低了主动脉内皮细胞NF-κB p65的表达，同时增加IκB-α的表达［15］。

这些结果表明，H2 S通过降低 ox-LDL诱导的内皮细胞ROS的产生和NF-κB的活化从而抑制TF的表达。

综上所述，NaHS抑制ox-LDL对血管内皮细胞TF表达的诱导作用与其抑制ROS-NF-κB途径有关。

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