子囊菌的分离_分布及其生理活性的研究_刘梅

子囊菌的分离、分布及其生理活性的研究
刘 梅1,2,张 鹏1,崔晓兰2,丁彦博2,郑智慧2,董悦生2,张 华2
(1.北京化工大学生命科学与技术学院,北京 100029;
2.华北制药集团新药研究开发有限责任公司微生物药物国家研究工程中心,河北石家庄 050015)
摘 要:采用子囊菌的选择性分离方法分离土壤样品,分离得到的子囊菌比例为常规稀释法的2.8倍;对子囊菌在河北、广西、云南等地的分布情况进行初步统计,云南省的子囊菌资源较丰富;应用多个药物筛选模型对分离得到的真菌进行筛选,在Caspase_3模型中,子囊菌的活性菌株是其他真菌的2.3倍.
关键词:子囊菌;分离;分布;生理活性;Caspase _3
中图分类号:Q 93 文献标识码:A 文章编号:1000-1565(2006)01-0058-03
Isolation,Distribution and Physiological Activity of Ascomycete
LIU Mei 1,2,ZHAN G Peng 1,C UI Xiao -lan 2,DIN G Yan _bo 2,ZHE NG Zh -i hui 2,
DONG Yu e -sheng 2,ZH AN G H ua 2
(1.C ollege of Life Scienc e and Technology ,Beijing University of Chemical Technology ,Beijing 100029,China;2.National M icrobial Medicine Engineering &Research Center,New Drug Research and Development
Co.,Ltd of North China Pharmaceutical Corporation,National M icrobial Medicine
Eng ineering &Research Center,Shijiazhuang 050015,China)
Abstract:The number of Ascomycote isolated from soil sam ples by the selective method w as 2.8times as that by the conventional method.The distribution of Ascomycote in H ebei,Guangx i and Yunnan provinces was investigated.The results show ed that Ascomy cote was much abundant in soil of Yunnan province.The metabo -lites of isolated fungi w ere then screened by drug screening models and the hit rate of metabolites produced by Ascomycote w as 2.3times as that of other fung i in the Caspase _3inhibitor screening.
Key words:Ascomycote;isolation;distribution;physiological activity;Caspase_3
在真菌中,子囊菌亚门(Ascomycotina)是最大的一个亚门,呈现了最为广泛和最复杂的分化现象,特别是在有性繁殖阶段,异核的营养菌丝体形成了同核的子实体,此过程包括了复杂的组织分化、基因启动和生化调节等.此外子囊菌对环境的适应能力、对其他生物难利用基物的特有利用能力等特性,表明了其次生代谢过程的复杂性与灵活性[1].
据J.Antibiotics 报道统计(1993-1999),产生生理活性物质的真菌有308种,其中子囊菌只占10%,说明在世界范围内对子囊菌的研究还是较新的课题.因此从资源入手,研究子囊菌的分离、分布是获得有价值的药用先导化合物的有效途径之一.但是,应用常规土壤稀释分离方法分离得到的真菌中,子囊菌的比例较 收稿日期:2005-09-16
基金项目:国家科技部创新药物筛选技术平台研究资助项目(2002AA2A Z343D)
作者简介:刘 梅(1968-),女,河北滦南人,华北制药集团高级工程师,主要从事微生物资源及菌种选育方面研究.
第26卷 第1期2006年 1月
河北大学学报(自然科学版)
Journal of H ebei University(Natural Science Edition)
Vol.26No.1Jan.2006
低.Ito等用热处理的方法,Yokoyama等用乙醇处理的方法选择性分离子囊菌,分别得到9属16种,2属3种的子囊菌[2].本课题组采用选择性分离子囊菌的方法,从河北、云南、广西的土壤样品中选择性分离子囊菌并对其分布情况进行了统计,同时比较了子囊菌和其他真菌在多个药物筛选模型中的活性,本文对实验结果进行报道.
1材料与方法
1.1土样采集方法
采土深度为地下5~10cm.土质、植被、地貌等尽量多种多样.
1.2常规真菌稀释分离方法
1.2.1培养基分离培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA/4);斜面培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA).
1.2.2分离方法2g土样加入18mL无菌水,220r/min振荡1h,稀释至10-3,取0.1mL加入分离培养基中涂平板,28e培养3~5d.挑菌接斜面,28e培养7~14d,排除重复和染菌斜面,编号,保藏.
1.3子囊菌选择性分离方法
1.3.1培养基同1.
2.
1.3.2分离方法2g土样应用物理(热处理)[2]、化学方法(乙醇处理法)[2]进行预处理,后同1.
2.
1.4真菌代谢产物的制备
1.4.1培养基斜面培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA);种子培养基(g/L):淀粉10,葡萄糖10,黄豆饼粉2,麦芽粉6,酵母粉5,CaCO32,Mg SO4#7H2O2;NaCl2;pH7.0;发酵培养基(g/L):淀粉20,葡萄糖20,黄豆饼粉13,酵母粉4,麦芽粉8,NaCl5,CaCO31.5,pH7.0.
1.4.2发酵斜面挖块法接种于种子培养基中,27e,220r/min振荡培养2~3d,以3%接种量接入发酵培养基中,27e,220r/min振荡培养5~6d.
1.4.3提取发酵液中加入等体积乙酸乙酯混合,浸泡3h或振荡混匀30m in,取上清液加入96孔板,用冷冻旋转浓缩仪抽干,加入适量二甲基亚砜,以备筛选.
1.5药物模型的高通量筛选
应用Caspase_3,HLE,Factor_X,抗白色念珠菌等多种药物筛选模型,采用多酶标计数仪(丹麦Wallac V ictorÒ)对制备的真菌代谢产物进行活性测定.
2结果与讨论
2.1土壤样品采集结果
在土质、植被、地貌多样性的原则指导下,从河北、广西、云南共采集土壤样品305份,具体的采集信息见表1.
表1土壤样品的采集情况
Tab.1Collection of soil samples
采集地点
河北
保定市平山县井陉县广西
桂林
云南
楚雄州雕岭山楚雄州紫溪山安宁县龙山
采集份数53575420374222各省合计16420121
土样合计305
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第1期刘梅等:子囊菌的分离、分布及其生理活性的研究
2.2 子囊菌的选择性分离
共分离真菌2924株.应用常规土壤稀释分离方法分离878株,其中子囊菌71株,占8.1%.应用选择性分离方法分离2046株,其中子囊菌为464株,占22.7%.应用选择性分离方法提高了子囊菌的分离率,分离得到的子囊菌为常规稀释法的2.8倍.2.3 子囊菌的分布
对不同地域的土样分离到的子囊菌进行统计,平均每份河北土样可分离出子囊菌1.1株,广西土样为1.3株,云南土样为3.0株.对云南省不同地域分离到的子囊菌进行统计,平均每份龙山土样分离子囊菌1.8株,雕岭山土样为2.5株,紫溪山土样为4.7株.云南省的气候、地理条件等决定了其生物多样性较好,其土壤样品中子囊菌资源比河北、广西等地域丰富.云南省内的不同地区的生态环境差别也比较大,其中紫溪山的生态环境保存较好,植被多样性好,其子囊菌资源较其他地域丰富.以上统计结果说明,不同的生态环境对土壤中子囊菌的种类及数量有较大影响.2.4 子囊菌的生理活性研究
应用多种药物筛选模型,对所有分离到的2924株真菌的代谢产物进行活性测定,结果显示,在Caspase _3模型筛选中,子囊菌的活性菌株是其他真菌的2.3倍;在HLE 模型筛选中,子囊菌的活性菌株是其他真菌的1.3倍;在Factor_X 和抗白色念珠菌模型筛选中子囊菌的活性菌株比例与其他真菌相近(见表2).Cas -pase _3是Caspases 家族中的成员,是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶,是治疗神经退行性疾病的新靶点,寻找Caspase_3高效高选择性的抑制剂将为治疗神经退行性疾病提供新的途径[3]
.子囊菌的代谢产物在Cas -pase _3模型中的活性率远大于其他真菌,说明其在开发神经退行性疾病药物领域有较大潜力.
表2 子囊菌与其他真菌的生理活性比较
Tab.2 Differences of physiological activity between Ascomycete and other fungi
模型靶点Caspase_3HL E F actor_X 抗白色念珠菌
相关疾病
神经退行性疾病
抗炎抗血栓抗真菌子囊菌中活性株比例/%12.415.6 5.1 5.6其他真菌中活性株比例/%
5.3
11.8
5.3
5.2
到目前为止,人们只分离到自然界实有微生物总数的1%,新物种就意味着存在新的基因,有新基因就有新的产物,有新产物就可能有新用途.因此未知微生物是最值得开发的资源[4].开展我国微生物资源的研究和积累,并积极学习国外药物研发的新理念,是增强我国企业与国外制药公司的竞争力、开发有自主知识产权创新药物的捷径.
参 考 文 献:
[1]梁宗琦.真菌次生代谢产物多样性及其潜在应用价值[J].生物多样性,1999,7(2):145-148.[2]渡边恒雄.土壤丝状菌[M ].东京:SOF T SCIEN CE PU BL ICA T IO NS,1993:6-9.
[3]张亚辉,李 佳,周忠良.Caspase _3:治疗神经退行性疾病的新靶点[J].生物化学与生物物理进展,2003,30(2):175-179.
[4]姜成林,徐丽华.微生物资源开发利用[M ].北京:中国轻工业出版社,2001.
(责任编辑:孟素兰)
#60#河北大学学报(自然科学版)2006年。