RORα高表达对二烯丙基二硫抑制人胃癌细胞增殖与迁移侵袭的影响

RORα高表达对二烯丙基二硫抑制人胃癌细胞增殖与迁移侵
袭的影响
苏坚;夏红;曾颖;苏波;刘芳;凌晖;曾希;苏琦
【摘要】目的观察高表达RORα 对二烯丙基二硫(DADS)抑制人胃癌MGC803细胞增殖、迁移与侵袭的影响.方法集落形成实验与流式细胞术检测细胞增殖与细胞周期;细胞划痕和Transwell实验分别检测细胞迁移与侵袭.RT-PCR与Western blot分别检测RORα、MMP-9和TIMP3 mRNA与蛋白表达水平.结果 RT-PCR 与Western blot检测显示,RORα 高表达与DADS处理较对照组与空载体组RORαmRNA与蛋白表达明显上调,DADS+RORα 高表达组上调更为显著
(P<0.05).与对照组和空载体组比较,RORα 高表达与DADS处理组MMP-9表达下调,TIMP3表达上调,DADS+RORα 高表达组改变最为显著.集落形成实验显
示,RORα 高表达与DADS处理组较对照组与空载体组的集落形成率明显降低.流式细胞术显示,与对照组和空载体组比较,RORα 高表达与DADS处理组G2/M期细胞比率明显升高.细胞划痕和Transwell实验显示,RORα高表达与DADS处理组细胞迁移与侵袭能力明显降低.结论RORα 高表达可通过上调TIMP3与下调MMP-9促进DADS阻滞MGC803细胞G2/M期和抑制增殖与迁移侵袭.
【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》
【年(卷),期】2019(028)003
【总页数】8页(P228-235)
【关键词】RORα;二烯丙基二硫;人胃癌MGC803细胞;增殖;迁移;侵袭
【作者】苏坚;夏红;曾颖;苏波;刘芳;凌晖;曾希;苏琦
【作者单位】南华大学附属第二医院病理科,衡阳 421001;南华大学肿瘤研究所,湖南省肿瘤细胞与分子病理学重点实验室,湖南省胃癌研究中心,衡阳 421001;南华大学附属第二医院病理科,衡阳 421001;南华大学附属第二医院病理科,衡阳 421001;南华大学附属第二医院病理科,衡阳 421001;南华大学附属第二医院病理科,衡阳421001;南华大学附属第二医院病理科,衡阳 421001;南华大学附属第二医院病理科,衡阳 421001;南华大学附属第二医院病理科,衡阳 421001
【正文语种】中文
【中图分类】R735.2
维甲酸受体相关孤儿受体α（retinoic acid receptor-related orphan receptor α，RORα）是维甲酸受体相关孤儿受体超家族主要成员，具有调控免疫、生理节律、脂质代谢、炎症与肿瘤生物学等功能。

RORα在乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、
黑色素瘤等肿瘤中表达下调，提示RORα可能是肿瘤防治的潜在靶点[1-4] 。

研究表明，二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭的作用[5] 。

我们之前采用蛋白质组学技术鉴定DADS作用人胃癌MGC803
细胞的潜在靶点，发现RORα蛋白上调[6] ；此后的研究提示，DADS上调RORα可抑制Wnt/β-catenin通路靶基因表达 [7] ；并且RORα高表达可下调Wnt/β-catenin通路靶基因表达，抑制胃癌细胞增殖与迁移侵袭[8,9] 。

本研究进一步探
讨RORα高表达对DADS抑制胃癌细胞增殖与迁移侵袭的影响。

材料和方法
1 细胞培养
人胃癌MGC803细胞由本实验室保存，稳定高表达RORα人胃癌MGC803细胞由本实验室先前构建[9] ，置于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，37℃，
5%CO2、饱和湿度的培养箱内传代培养，取对数生长期的细胞用于实验。

2 抗体与主要试剂
RORα与β-actin抗体购自Abcam公司；MMP-9与TIMP3 抗体和ECL发光试
剂盒购自Santa Cruz公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒与BCA蛋白定量试剂盒购自Promega公司；DADS为Fluka公司产品，按照1:2的比例将DADS
溶解于Tween 80，再用生理盐水稀释100倍后置于-20℃冰箱备用；新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司。

用Primer Premier 5.0软件设计引物，由上海生
工公司合成。

3 实验分组
将细胞分为对照组（Con）、空载体组（Vec）、RORα稳定高表达组（RORα）、对照DADS处理组（DADS）、空载体DADS处理组（Vet+DADS）和RORα稳定高表达+DADS组（RORα+DADS），其中Con为野生型MGC803细胞，Vec 为转染表达制备RORα高表达质粒的空载体的MGC803细胞。

4 软琼脂集落形成实验
用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化并制备单细胞悬液。

在1ml RPMI 1640培
养基中重悬1000个细胞，接种于含有0.5%琼脂的固体培养基上，培养7d后观
察细胞克隆形成情况。

按照相对集落形成率=实验组集落数/对照组集落数×100%，集落抑制率= 1-实验组集落形成率/对照组集落形成率×100%，计算各组的集落形成率与集落抑制率，实验重复3次。

5 流式细胞术检测
0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化制成单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤和重悬细胞，1000r/min×5min离心，重复1次；加入预冷的乙醇，放置4℃过夜，置于
冰盒中送检；1000r/min×5min离心，预冷PBS洗涤，加入50μl RNA酶，37℃水浴30min，加入50μl碘化丙啶，放置4℃ 30min；用300目尼龙网滤过后上
流式细胞仪检测，实验重复3次。

6 划痕实验
将各组细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化，将0.8×105个细胞接种至12
孔培养板中，每组设置3个平行样本。

在RPMI 1640细胞培养基中培养，直至形
成细胞单层。

20μl的tip头垂直板面划痕，RPMI1640培养基常规培养。

倒置显
微镜下观察、测量划痕区相对距离，实验重复3次。

7 Transwell实验
将基质胶稀释液铺置在Transwell小室中制成膜，加无血清RPMI 1640培养液
100μl至Transwell小室上腔，水化基质胶20 min。

取100μl各组细胞稀释液接
种至小室上腔，下腔中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液500μl。

37 ℃、5% CO2的培养箱中培养48 h，取出小室，擦弃小室上层细胞，PBS液洗3次，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶祡染色，PBS液清洗。

光镜下随机选取4个高倍视野进行细胞计数，实验重复3次。

8 RT-PCR分析
RNA试剂盒提取细胞总RNA，AMV 酶作用下逆转录合成 cDNA。

PCR引物序列
见表1。

PCR反应条件：94℃，5min；94℃，40sec，各基因Tm，45sec，72℃ 1min 20sec，28 个循环；72℃ 10min。

5μl的PCR产物经1%的琼脂糖电泳，
嗅化乙啶染色，IS1000图像分析软件读取目的条带灰度值，相对值以目的基因与
β-actin灰度值之比表示，实验重复3次。

表1 PCR引物序列与扩增长度Tab. 1 Sequences and amplification length of the primers for PCR基因引物序列扩增长度(bp)RORα F 5’-GTCAGCAGCTTCTACCTGGAC-3’ 151 R 5’-CAGTTGGGGAAGTCTCGCCG-3’TIMP3 F 5’-A ACTTGGGTGAAGGCTGAGTGT-3’ 801 R 5’-CATGAGGCAGGTCT GGAACG-3’MMP-9 F 5’-
GTGCTGGGCTGCTGCTTTGCTG-3’ 255 R 5’-TGGGGTTCGCATGGCCTTCA-3’β-actin F 5’-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’ 498 R 5’-GGAACCGCTCATTGCCAATG-3’
9 Western blot检测
收集各组细胞1×106个，加100μl裂解液，冰上裂解1h，低温高速离心收集蛋白，BCA蛋白定量测定蛋白浓度。

每孔加30μg蛋白，以5:1体积与5×SDS缓冲液混合，100℃ 5min，10% SDS-PAGE凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上，用
含5%脱脂牛奶的TBST（Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 137mmol/L含0.1% Tween-20）封闭2h，TBST洗膜3次，一抗37℃孵育2h，TBST洗15min×3次，二抗孵育1h，TBST洗10min×3次，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。

10 统计学分析
各组实验数据采用均值±标准差表示，SPSS 13统计软件进行分析，结果比较采用t检验，P＜0.05为差异具有显著性意义。

结果
1 RORα高表达促进DADS对MGC803细胞RORα表达的上调
RORα稳定高表达MGC803细胞的RORα mRNA与蛋白表达较对照组与空载体
组显著上调；30 mg/L DADS处理使野生型MGC803细胞和Vec组MGC803细胞的RORα mRNA和蛋白表达显著上调，使稳定高表达RORα 的MGC803细胞RORα mRNA和蛋白表达上调更为明显（图1)。

2 RORα高表达增强DADS对MGC803细胞增殖的抑制
软琼脂集落形成实验显示，RORα高表达可增强DADS的集落抑制作用（表2）：DADS未处理时，RORα高表达MGC803细胞的集落形成率明显降低，相对于Con组和Vec组细胞，其集落抑制率分别为65.10%与63.38%；30mg/L DADS
作用后，MGC803细胞的集落形成率也明显降低，相对Con组和Vec组细胞，
集落抑制率分别为64.43%与60.57%，而RORα稳定高表达细胞用DADS处理
对集落形成的抑制更为明显，相对Con组和Vec组细胞，其集落抑制率分别为73.83%和72.54%，相对未用DADS处理的RORα稳定高表达细胞，抑制率增加25.01%，相对于单纯DADS处理的细胞，抑制率增加26.42%。

3 RORα高表达增强DADS对MGC803细胞周期的阻滞
流式细胞术检测显示（图2），RORα高表达组细胞G2/M期百分率42.1%较对
照组21.5%和空载体组 22.4%明显增加 (P＜0.01； n=3)；30 mg/L DADS处理
也使G2/M期百分率明显增加，Con+DADS组和Vec+DADS组G2/M期百分率分别为44.0%与41.9%，均出现明显的G2/M期阻滞；RORα高表达可轻度增强DADS对G2/M期的阻滞作用 (P＞0.05；n=3)。

4 RORα高表达与DADS对MGC803细胞迁移的影响
划痕实验显示（图3），24 h后，RORα高表达细胞和30 mg/L DADS处理细胞的迁移距离均明显小于Con组与Vec组；RORα+DADS组细胞的迁移距离较Con组与Vec组明显减小，较单纯RORα高表达组和单纯DADS处理组略减小。

图1 RORα高表达与DADS对MGC803细胞RORα表达的影响。

A，RT-PCR检测；B，Western blot检测；*P＜0.01，与Con或Vec比较；#P＜0.01，与RORα组比较；n=3Fig. 1 Effect of RORα overexpression and DADS on expression of RORα in MGC803 cells. A, detection by RT-PCR； B, detection by Western blot；*P＜0.01, compared with Con or Vec； #P＜
0.01, compared with group RORα, group DADS or group Vec+DADS； n=3 表2 RORα高表达与DADS对MGC803细胞增殖的影响Tab. 2 Effect of RORα overexpression and DADS on proliferation of MGC803 cells*P＜0.01 vs Con or Vec； #P＜0.01 vs RORα group； n=3Group 集落形成数相对集落形成率
（%）Con 14.9±1.7 100 Vec 14.2±1.4 95.30 RORα 5.2±0.8* 34.90*DADS 5.3±1.1* 35.57*Vec+DADS 5.6±0.7* 37.58*RORα+DADS 3.9±1.2*# 26.17*# 5 RORα高表达促进DADS对MGC803细胞侵袭能力的抑制
Transwell侵袭实验显示（图4），RORα高表达组穿膜细胞数37±9个，较Con 组147±2个与Vec组144±2个明显减少 (P＜0.01； n=3)；30 mg/L DADS 处理后较处理前穿膜细胞数明显减少 (P＜0.01； n=3)，其中Con+DADS组和Vec+DADS组分别为35±4和34±6个较RORα组+DADS组穿膜细胞数31±5个无显著性差异 (P＞0.05； n=3)。

6 RORα高表达促进DADS对MGC803细胞MMP-9的下调和TIMP3的上调为了了解RORα高表达和DADS处理影响MGC803细胞增殖、迁移和侵袭的机制，进一步检测了RORα高表达结、DADS处理和二者的联合对MGC803细胞MMP-9和TIMP3表达的影响。

RT-PCR和Western blot检测显示（图5、图6），与Con组合Vec组比较，RORα高表达组MMP-9 mRNA与蛋白水平明显降低TIMP3 mRNA与蛋白上明显升高；DADS处理与RORα高表达效果相似，而RORα高表达组与DADS联合处理使MMP-9的下调和TIMP3的上调更为显著。

图2 RORα高表达与DADS对MGC803细胞周期影响的流式细胞术检测Fig. 2 Flow cytometry analysis for effect of RORα overexpression and DADS on cell cycle of MGC803 cells
图3 RORα高表达与DADS处理对MGC803细胞迁移能力影响的划痕实验检测Fig 3 Scratch assay detection for effect of RORα overexpression and DADS treatment on the migration of MGC803 cells
讨论
研究证明，RORα作为候选抑癌基因，可能是乳腺癌、结直肠癌、胃癌、黑色素
瘤等肿瘤的治疗靶点[1,2] 。

RORα在乳腺癌中表达下调或活性下降，提高RORα
表达可通过经典与非经典的核受体途径抑制细胞增殖与侵袭[2] 。

Xiong 等报告，RORα表达在乳腺癌组织和细胞系中显著降低，与患者减少生存、乳腺腺泡结构
破坏和体内癌演进相关。

RORα高表达可显著抑制癌细胞的恶性表型与增殖与侵
袭和裸鼠肿瘤生长，而沉默乳腺癌细胞RORα表达可提高细胞侵袭和破坏正常组
织结构促进乳腺癌的发生与发展。

并且，RORα是SEMA3F转录调节因子，
RORα表达可促进SEMA3F上调，恢复RORα或SEMA3F在乳腺癌细胞表达抑
制侵袭和肿瘤生长，抑制RORα-SEMA3F轴促进乳腺癌的的发生发展 [10] 。

最
近的研究显示，在122例乳腺癌中，发现RORα变异体rs4774388可增加乳腺癌的危险，提示RORα在乳腺癌发生中起着抑癌基因的作用[3] 。

另有研究表明，RORα在黑色素瘤低表达与侵袭转移、临床分期和不良预后密切相关，可作为治
疗黑色素瘤与新的药物靶点[11] 。

Wang等发现，RORα在胃癌中表达下降与肿
瘤大小、肿瘤分化、TNM分期和淋巴结转移显著有关，RORα减少的机制是由于AMPK活性降低。

采用AMPK活化剂AICAR处理可增加RORα活性与表达水平，促进FBXM7、SEMA3F与p21等抑癌基因表达，从而诱导胃癌细胞凋亡 [12] 。

图4 RORα高表达与DADS对MGC803细胞侵袭能力影响的Transwell实验分
析Fig. 4 Transwell assay analysis for effect of RORα overexpression and DADS treatment on invasion of MGC803 cells
图5 RORα高表达与DADS处理对MGC803细胞MMP-9表达的影响。

A，RT-PCR检测；B，Western blot检测；* P＜0.05, 与Con组或Vec组比较（n=3）Fig. 5 Effect of RORα overexpression and DADS treatment on MMP-9 expression in MGC803 cells. A, detection by RT-PCR； B, detection by Western blot； *P＜0.05 vs Con or Vec (n=3)
近年来，研发诱导RORα表达的药物为肿瘤治疗开拓了新的途径。

例如，小分子
Nedd8活化酶抑制剂MLN4924减少RORα泛素化稳定RORα，上调RORα及其p21与Bmal1表达[13] 。

Neoruscogenin能活化RORα并影响其靶基因表达[14] 。

RORα激动剂SR1078处理人神经母细胞瘤细胞，增加RORα靶基因
A2BP1、CYP19A1、NLGN1与 IPTR 表达 [15] 。

RORα高表达或SR1078处理可下调PDK2表达与磷酸化，上调p21，抑制肝癌生长 [16] 。

图6 RORα高表达与DADS处理对MGC803细胞TIMP3表达的影响。

A，RT-PCR检测；B，Western blot检测；* P＜0.05, 与Con组或Vec组比较（n=3）Fig 6 Effect of RORα overexpression and DADS treatment on TIMP3 expression in MGC803 cells. A, detection by RT-PCR； B, detection by Western blot； *P＜0.05 vs Con or Vec (n=3)
我们以往的研究显示，蛋白质组学技术鉴定DADS作用人胃癌MGC803细胞的潜在靶点，发现RORα蛋白上调[6] 。

RORα高表达可下调W nt/β-catenin通路靶基因表达，抑制胃癌细胞增殖与迁移侵袭[8,9] 。

DADS通过Rac1-Pak1/Rock1通路下调LIMK1、MMP-9和上调TIMP-3，抑制MGC803细胞增殖、EMT与侵袭[17] 。

本研究结果表明，RORα高表达与DADS处理可抑制MGC803细胞增殖、迁移和侵袭，显著下调MMP-9和上调TIMP3，而DADS处理RORα高表达组最为显著，证明RORα高表达不仅可抑制MGC803细胞增殖与迁移侵袭，而且可增强DADS抑制MGC803细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

参考文献
【相关文献】
[1] Fan J, Lv Z, Yang G, Let al. Retinoic Acid Receptor-Related Orphan Receptors: Critical Roles in Tumorigenesis. Front Immunol, 2018, 9: 1187.
[2] Du J, Xu R. RORα, a potential tumor suppressor and therapeutic target of breast cancer. Int J Mol Sci, 2012, 13(12):15755-15766.
[3] Taheri M, Omrani MD, Noroozi R, et al. Retinoic acid-related orphan receptor alpha (RORA) variants and risk of breast cancer. Breast Dis, 2017, 37(1): 21-25.
[4] Kojetin DJ, Burris TP. REV-ERB and ROR nuclear receptors as drug targets. Nat Rev Drug Discov, 2014, 13(3): 197-216.
[5] Yi L, Su Q. Molecular mechanisms for the anti-cancer effects of diallyl disulfide. Food Chem Toxicol, 2013, 57: 362-370.
[6] Su B, Su J, He H, et al. Identification of potential targets for diallyl disulfide in human gastric cancer MGC-803 cells using proteomics approaches. Oncol Rep, 2015, 33(5): 2484-2494.
[7] 苏坚，赵晓红，向姝霖，等. 二烯丙基二硫上调RORα抑制人胃癌细胞Wnt/β-catenin通路靶基因. 中国药理学通报，2017，33（4）：522-528.
[8] 苏坚，赵晓红，刘芳，等. RORα高表达抑制人胃癌MGC803细胞Wnt/β-catenin信号通路
靶基因表达. 中国细胞生物学学报，2016，38（11）：1358-1365.
[9] 赵晓红，刘芳，向姝霖，等. RORα高表达对人胃癌MGC803细胞增殖与迁移侵袭的影响. 肿瘤防治研究，2016，43（11）：926-932.
[10] Xiong G, Wang C, Evers BM, et al. RORα suppresses breast tumor invasion by inducing SEMA3F expression. Cancer Res, 2012, 72(7): 1728-1739.
[11] Brożyna AA, Jóźwicki W, Skobowiat C, et al. RORα and RORγ expression inversely correlates with human melanoma progression. Oncotarget, 2016, 7(39): 63261-63282. [12] Wang Z, Xiong F, Wang X, et al. Nuclear receptor retinoid-related orphan receptor alpha promotes apoptosis but is reduced in human gastric cancer. Oncotarget,
2017,8(7):11105-11113.
[13] Zhang S, Zhang J, Deng Z, et al. Circadian clock components RORα and Bmal1 mediate the anti-proliferative effect of MLN4924 in osteosarcoma cells. Oncotarget. 2016,7(40): 66087-66099.
[14] Helleboid S, Haug C, Lamottke K, et al. The identification of naturally occurring neoruscogenin as a bioavailable, potent, and high-affinity agonist of the nuclear receptor RORα(NR1F1). J Biomol Screen, 2014, 19(3): 399-406.
[15] Wang Y, Billon C, Walker JK, et al. Therapeutic Effect of a Synthetic RORα/γ Agonist in an Animal Model of Autism.ACS Chem Neurosci, 2016, 7(2): 143-148.
[16] Byun JK, Choi YK, Kang YN, et al. Retinoic acid-related orphan receptor alpha reprograms glucose metabolism in glutamine-deficient hepatoma cells. Hepatology, 2015, 61(3):953-964.
[17] Su B, Su J, Zeng Y, et al. Diallyl disulfide suppresses epithelial-mesenchymal transition,
invasion and proliferation by downregulation of LIMK1 in gastric cancer. Oncotarget,2016, 7(9): 10498-10412.。