糖尿病大鼠心肌组织中Survivin蛋白表达的阻碍

糖尿病大鼠心肌组织中Survivin蛋白表达
的阻碍
马计张端莲高凌李培安
【摘要】目的：研究糖尿病大鼠心肌组织中Survivin蛋白表达与糖尿病发病机制的研究。

方式：按体重随机分为正常对照组(10只)和糖尿病组(20只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg 的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌(streptozotocin,STZ)溶液,正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液，观看动物饮水、进食及尿量转变等情形。

一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> L 、饮水量> 40 ml/ d 、尿糖强阳性的大鼠作为糖尿病大鼠，然后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验。

结果：正常对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒，Survivin蛋白呈阴性表达；糖尿病组心肌细胞胞浆内可见密集散布的棕黄色颗粒，Survivin蛋白表达呈强阳性。

图像分析结果显示，正常对照组和糖尿病组平均光密度别离为±、±，正常对照组和糖尿病组阳性面积率别离为±、±。

正常对照组与糖尿病组之间平均光密度及阳性面积率的不同有显著性意义(P<。

结论：Survivin蛋白对心肌细胞凋亡起着重要作用。

【关键词】糖尿病心肌 Survivin蛋白免疫组化
糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种多病因的代谢疾病，
由于胰岛素分泌缺点和（或）胰岛素作用缺点从而引发糖、蛋白质、脂肪代谢异样，特点是慢性高血糖。

高血糖得不到有效操纵可能损害血管和神经，最终致使慢性并发症发生进展，如糖尿病视网膜病变、心血管病变、糖尿病肾病、糖尿病足、糖尿病神经病变和性功能障碍等。

因此，糖尿病初期诊断和医治能够减少发生并发症的危险性。

心肌细胞凋亡不仅由特定的基因调控, 还受细胞周围的刺激信号诱导或抑制, 外源性因子可通过必然途径发挥刺激效应。

目前的研究说明, 阻碍心肌细胞凋亡的因素很多, 归纳起来, 要紧有物理性、化学性和生物性因素3大类, 这些因素中有生理性的或病理性的, 也有促发性的或抑制性的。

存活素(suvrvini)是新近发觉的AIP家族新成员，目前以为其可抑制凋亡信号传导通路的终末效应子caspase-3而发挥抗凋亡作用［1］。

本研究采纳免疫组织化学方式观看了高血糖引发的心肌细胞的凋亡作用，旨在讨论和寻觅医治糖尿病和爱惜心肌的实验依据。

1 材料与方式
材料
实验动物昆明种SD大鼠30只,雄性,体重180～200g ,由武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1周后进行实验。

方式
动物模型成立及分组按体重随机分为正常对照组(10只)和糖尿病组(20只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌(streptozotocin ,STZ)溶液(用 L、pH = 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液，观看动物饮水、进食及尿量转变等情形。

一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性的大鼠作为糖尿病大鼠，然后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验。

实验期间,紧密观看动物进食和饮水量转变,每周称两次体重。

要紧试剂浓缩型兔抗鼠Survivin单克隆抗体盒(北京中山生物技术) ；超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒(北京中山生物技术) ；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术）。

要紧仪器 YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安电子器材厂生产；家用高压锅。

常规HE染色以上各组动物实验完毕后,将各组动物从心底部剪取心脏,切下心室。

4%多聚甲醛固定、包埋、石蜡切片、HE染色。

免疫组织化学S-P法检测Survivin蛋白相关抗原
要紧步骤：
①组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；
② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；
③ Survivin采纳微波抗原修复（3档，10 min）， PBS洗4×5min；
④正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反映；
⑤一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；
⑥生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
⑦链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反映；
⑨苏木精复染，脱水，透明，封片。

用PBS代替一抗作为阴性对照。

免疫组织化学结果判定
Survivin蛋白以胞浆显现棕黄色颗粒为阳性反映。

阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反映物。

采纳HPIAS-2000高清楚度彩色病理图文报告治理系统（同济千屏影像公司）对Survivin蛋白表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每一个视野下阳性反映的平均光密度、阳性反映面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。

以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

（阳性面积率＝单位面积中阳性反映的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）
统计学处置
对各组免疫组织化学反映阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q查验，查验水准α为。

2 结果
正常对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒，Survivin蛋白呈阴性表达；糖尿病组心肌细胞胞浆内可见密集散布的棕黄色颗粒，Survivin蛋白表达呈强阳性。

图像分析结果显示，正常对照组和糖尿病组平均光密度别离为±、±，正常对照组和糖尿病组阳性面积率别离为±、±。

正常对照组与糖尿病组之间平均光密度及阳性面积率的不同有显著性意义(P<，见表1。

表1 正常对照组与糖尿病组心肌细胞内Survivin表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注：* 正常对照组与糖尿病组比较，P＜。

3 讨论
糖尿病是目前临床学科中进展最迅速的学科之一。

随着对糖尿病研究的不断深切,人们已慢慢熟悉到糖尿病的本质是血管病变。

1999年,美国心脏学会提出,糖尿病是一种心血管疾病。

目前,大血管病变是糖尿病患者死亡的要紧缘故,事实上,若是糖尿病没有血管并发症,糖尿病将再也不是一个重大的公共健康难题。

在糖尿病大血管病变形成进程中,胰岛素抗击、内皮功能紊乱和局部RAS激活等起重要作用。

胰岛素抗击在代谢综合征的形成中起重要作用,是心血管疾病(CVD)独立的预测因子。

胰岛素抗击可在2型糖尿病发生20～30年前就存在,在糖尿病发病前就可能对心血管系统造成不可逆损害。

UKPDS研究证明,新诊断的2型糖尿病患者中有近50%显现了大血管并发症的临床证据。

胰岛素抗击的表型很多,除糖尿病外,还可致使高血压、慢性全身性疾病和内皮细胞功能紊乱等,并最终形成动脉粥样硬化。

能够说,胰岛素抗击是2型糖尿病与CVD的桥梁。

RAS 与糖尿病之间关系紧密,糖尿病患者局部组织内RAS的激活和AT1受体对AngII的高灵敏可能独立于系统RAS。

内皮功能失衡是动脉粥样硬化的始动和核心环节,2型糖尿病在血管病变显现前数年就有内皮功能受损的标志物升高,而且内皮功能受损还常与胰岛素抗击归并存在,二者彼此协同,一起增进动脉粥样硬化的形成。

代谢综合征包括的各类心血管危险因素都可引发内皮细胞功能紊乱,因此保护内皮细胞功能平稳,单纯依托操纵血糖远远不够,只有全面操纵心血管危险因素,才能最终实现降低2型糖尿病心血管疾病发生率和死亡率的目的。

最近几年来,国内外许多学者通过临床和流行病学调查,和周密设计的基础研究和实验研究,尽管对糖尿病的病因有了较多的熟悉,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚。

有实验研究证明糖尿病性心肌病的特点性改变成间质改变和微血管改变。

Karnafel发觉糖尿病性心
肌病的病理改变有微血管变窄、微动脉瘤形成、心肌肥大、胶原结构改变、心肌纤维化及血管周的纤维化。

在糖尿病性心肌病中,心脏功能改变有心绞痛、心力衰竭和心律失常,左心室舒张功能障碍是糖尿病性心肌病的初期标志之一。

Cai等研究发觉,高血糖可直接致使活体心肌细胞凋亡,高血糖致使的心肌细胞凋亡至少部份是通过细胞色素 C 激活的caspase-3 途径的激活而操纵。

Cai等报导在糖尿病患者和动物模型中都可观看到心肌细胞死亡,通过抗氧化剂或凋亡信号途径的特异性抑制剂抑制心肌细胞死亡,能够明显的阻止糖尿病的心脏毒性,因此心肌细胞死亡在糖尿病性心肌病变中有重要作用。

Survivin 是凋亡蛋白抑制剂( Inhibitor of apoptotic protein, IAP) 家族的新成员［2～4］, 于1997年由耶鲁大学的Altieri 等应用效应细胞蛋白酶受体-1 (EPR-1) 的cDNA 通过杂交方式在人类基因组文库中挑选并鉴定出来, 是迄今克隆出的最小的IAP。

它特异性地表达于胚胎发育组织及分化未成熟组织，并在几乎所有恶性肿瘤组织中显现高表达［5，6］, 而在正常成人组织中不表达(胸腺、胎盘、子宫内膜除外), 而且与肿瘤的发生、进展及预后紧密相关［7～10］。

本研究结果显示，存活素在正常对照组心肌细胞内表达不明显，存活素在糖尿病组心肌细胞内表达较高。

这一表达不同提示，糖尿病组细胞中存活素的过度活化可能与心肌细胞的凋亡紧密相关，其
可能通过阻断凋亡，破坏细胞增殖/凋亡平稳。

【参考文献】
1 Temme A , R iegerM , Reber F, et al. Localization,dynamics, and function of survivin revealed by expression of functional survivinD sRed fusion proteins in the living cell. Mol Biol Cell, 2003，14(1)∶78.
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3 (4)∶401.
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5 Matsumoto G, Muta M , Umezawa K, of the caspase-independent apoptotic sensitivity of pancreatic cancer cells by DHM EQ, an NF-KappaB inhibitor. Int J Oncol,2005，27(5)∶1247.
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