壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价

壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法
学评价
830?
[文章编号]1000—4718(2005)04—0830—03
中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiolob,)’一!!21
实验技术?
壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价*
张艳玲2,刘然义,柯妙拉,陈洁敏,李晓红,叶春玲,黄文林
(?中山大学附属肿瘤医院619室,广东广州510059;暨南大学药学院药理学教研室,广东广州510632)
[摘要】目的:介绍壳蛋自免疫法hexoninmaunoassay),并同传统细胞病变(c陋)法比较,检测其可靠性和可
重复性.方法:3种重组腺病毒(Ad—lacz,Ad—hEndo和d/1520)扩增,提纯后,用壳蛋白免疫法,CPE法测定病毒滴
度及Az6o值法测定病毒总颗粒数.结果:壳蛋白免疫法和CPE法同时测定3种同批次病毒滴度,结果一致,P>
0.05:对不同批次3种腺病毒滴度测定,结果仍相似,平均差值牙±S=0.1527±0.3270,P>0.05,两法有很好的相关
性,r=0.913;壳蛋白免疫法对同批d/1520测定19次,变异系数仅为1.42%.结论:壳蛋白免疫法是测定腺病毒滴
度的有效方法,系统误差小,重复性好,结果客观可靠,可避免CPE法中由于细胞退化和工作人员主观判断造成的
系统误差,比CPE法更精确,更省时.
[关键词]腺病毒;壳蛋白免疫测定
[KEYWORDS]Adenovirus;Hexoninanunoassay
[中图分类号]R363[文献标识码]A
重组腺病毒在基因治疗领域中具有广阔应用前景.已
在囊性纤维化和癌症基因治疗中作为目的基因载体,如成胶
质细胞瘤,成神经细胞瘤,黑色素瘤以及恶性乳腺癌,结肠
癌,头颈癌,肝癌等LlJ.随着腺病毒载体广泛应用,急待建立
快速准确的腺病毒滴度测定方法.
目前有许多测定重组腺病毒滴度的方法,如荧光法,A26o
法,细胞病变(cpE)法和空斑法L2J.传统的腺病毒滴度测定
方法包括作用于单层细胞的CPE法和空斑法,均属于生物学
方法,需要10—14d甚至更多的时问.A260法是一种物理学
方法,仅耗时约1h,但测定的是病毒DNA和蛋白质总浓度,
无法区分有感染作用和无感染作用的病毒颗粒.通过检测
293细胞中病毒六联体壳蛋白的特异性反应可定量测定具有
感染活性的病毒颗粒,耗时约52h.其结果同标准CPE法有
一
定的可比性,但比CPE法省时问.
材料和方法
1细胞培养
整合有腺病毒E1区基因的永生化人胚肾细胞系293细
胞,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养.
2病毒
重组腺病毒152o,Ad—hEndo,Ad—lacz在293细胞中扩
增,然后用氯化铯密度梯度法纯化.纯化后的病毒保存于
一
80℃.
3劫法
梯度稀释病毒(50病毒+450溶剂),测260nln吸
光值.最后计算病毒滴度:腺病毒颗粒/mL=A值×稀释倍
数×1012[.
4壳蛋白免疫法
首先按10倍梯度稀释病毒,准备10..一10I76个稀释度
的病毒.然后用293细胞铺12孔培养板,不必细胞贴壁,直
接加入同体积各稀释度病毒.37℃培养48h.第3d,用抗壳
蛋白抗体,共轭辣根过氧化物酶二抗和DAB进行免疫组化染色.被感染的细胞呈褐色,很容易与非感染细胞区分.病毒
滴度通过计数特定区域中阳性细胞数获得,以感染单位/mL (WU/mL)表示,每个被染色的细胞对应一个感染单位(IFU).
r~(IFU/mL)=一(i.
nfecte
vi
d
ms
cell
(s
mL
/fie
)
ld
×
)(x…
(fie.
1ds/wel1)
vOltllnedilutionmctorjVlms,mLJ×～
5CPE法
用293细胞(每孔lO4个)种96孔板,培养约24h,细胞贴
壁并形成均匀单层.准备10～一109个稀释度的病毒,每
:tL~ll50止病毒,每列一个稀释度,共9列.余下3列加入培养液,作为空白对照.然后在37℃,5%C02培养10d.每天
显微镜下观察细胞病变情况.记录每一列病变情况,用Reed
—
Much公式【4J计算.
6统计学处理
所有数据以牙±S表示,结果用双测Student’St检验比较
差异显着性.
结果
1A260法
测得3个重组腺病毒Ad—lacz,Ad—hEndo,d/1520的总
病毒颗粒数分别是(1.820士0.o9o)x10VP/mI,,(3.390±
0.007)×102vP/rrlL,(2.340±0.002)×102vP/rrlL.
2CPE法和壳蛋白免疫法细胞形态学观察
由于CPE法和壳蛋白免疫法都是靠眼睛计数,所以形态
[收稿El期]2003—09—04[修回El期]2003一l1一o6
*[基金项目]广东省自然科学基金资助项目(No.021810);广东省医学科研基金资助项目(No.A2(X)227)
▲通讯作者Tel:O2O一85225631;020～87343146
特征对滴度铡定是非常重要的.细胞病空是予代病毒在感
细胞中过唰繁殖引起的.当病毒颗粒堆视时.感橐鲴胞脱
壁黼曲申状在培养摹中漂浮但当病毒浓度降1珏时,病亚
程度碱弱,形态特征不明显(iA一1E).
而在壳蛋白免疫法中,阳性细胞量褐色.无论病毒敬多
少都根容易计敦每一个色细胞代表一个感染单位(mI).
(罔从2E)
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图1细胞病变丹}态掌特祉
}gle~dsoIIex0niill¨uJlusvposltlv~IlDillor~ntdilutionsof1520we…edIoin fectIqEK293celandthetderswc
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10dilutio~slCD~ouldprovidethefield~.eIlsmullidealmrcounting
罔2壳蛋白免疫法中阳性钢胞形态学特征
●J
一
832?
3CI’E法和壳蛋白免疫法灵敏度比较
用CPE法和壳蛋白免疫法对3种重组腺病毒(同一批
次)的滴度进行多次重组测定(Ad—laez,,l=4;dl1520,,l=5; Ad—l1Dx玉0,,l=4),两种方法所得结果(图3)基本一致(尸> O.05),说明这两种方法灵敏度相似.
14
12
Ad.1aczd/I520Ad—hEndo
Fig3”literdebe田h嘞nimmm~assayc0玎a由ed讪诎
t=I】Eas明.Ad—la,dl1520,Ad—l】ade耵
吱0d【sweIeassayedbym段同】rillghe~onexpression(rapid
t盯m)越ldePEassay.P>0.05CPE.Ad—lacz
differen~i±s:一0.6300±0.2954,,l=4;dl1520dif-
ftenoei±s=一0.096o±0.1280,,l=5;Aa—ldair-
ferencei±s=0.1067±0.0296,,l=4.
图3壳蛋白免疫法和a法测定滴度结果相符
4a法和壳蛋白免疫法检测不同批病毒滴度的结果比较
通过对2l批病毒应用2种方法同时检测的结果统计,2
种方法检测结果相差的平均值i±s为0.1527±0.3270,尸> 0.05.统计每次试验的2种方法结果计算相关系数,r=
0.913,尸<0.01,说明2种方法有很好的相关性.因为我们用3种不同的重组腺病毒,所以说明我们的方法与载体携带的基因无关.
5壳蛋白免疫法的重复性
应用壳蛋白免疫法对同一批腺病毒dl1520滴定19次.
结果,置±s=9.745l6±0.1311396,CV%=1.42%.证实免疫
壳蛋白法系统误差小,可重复性好.
讨论
研究资料描述了用壳蛋白免疫法检测感染E1区缺陷型
腺病毒细胞中病毒蛋白表达的可行性.这种快捷而简便的
酶联免疫法可用于检测任何E1区缺陷腺病毒,此病毒因缺乏E1基因,只能在导人到整合有E1区基因的宿主细胞中才能进行复制.E1基因表达产物激活一些病毒蛋白表达,其中的壳蛋白的表达表明腺病毒已感染宿主细胞并开始复制,此为壳蛋白免疫法这一快速效价测定法的基础.此法只需约52h,受感染细胞为棕色,很容易和未感染细胞区别开来(图
2A一2E).感染细胞壳蛋白的表达很明显是病毒复制清晰的指示,也是一个用以快速检测的生物活性标识.因为在传统的CPE法出现细胞病变前的一个星期或更早,六联体壳蛋白就可以被稳定的检测出来.
用壳蛋白免疫法测腺病毒效价确切可靠.在对比分析
该法和CPE法,所获的结果相似(图3),关联性很大.CPE法
要求客观无偏差地评判细胞病变效应,但往往易受主观因素
的影响,因而不稳定,降低了精确度.从结果中可见这种快
捷方法具有可靠性和可重复性.我们发现cPE法和壳蛋白
免疫法所测得的这些载体的滴度与其携带的基因类型无关.
美国FDA建议临床治疗用腺病毒的总颗粒数与有感染
作用的颗粒数比值应当≤100.Mittereder等L5J证明,腺病毒总颗粒数与有感染作用的颗粒数的比例对维持最佳感染水平
起重要作用.建立快速测定腺病毒生物学滴度的可靠方法
为准确提供重组载体最大可能性活力指标所必须.我们用
A抽测定3种病毒总颗粒数,用ePE法和壳蛋白免疫法测得
生物学滴度.计算得出Ad—laeZ,Ad—l1E|x玉0,dl1520总颗粒数和lE法测得的有感染作用的颗粒数比值分别为1113.4, 553.7和24.5,与壳蛋白免疫法测得的有感染作用的颗粒数
比值分别为143.4,2362.5和30.6.获得病毒生物学活性一
致性的重要因素是病毒对细胞的作用时间保持一致L5』,当比较CPE和壳蛋白免疫法两种方法时或者是多次参照标准测
定时均须注意此点.
通过壳蛋白免疫法仔细地检查宿主细胞中壳蛋白表达
能够使研究者鉴定病毒结构,生产最有效治疗用的病毒.通
过壳蛋白法监测壳蛋白提供一个早期测定病毒感染活性的
方法,比其他生物学方法节省1—2周时间.这可能对腺病毒
从实验室走进临床发挥治疗作用具有重大意义.
[参考文献】
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