栝楼瞿麦汤干预糖尿病肾病大鼠 P38MAPK 炎症信号通路机制

栝楼瞿麦汤干预糖尿病肾病大鼠 P38MAPK 炎症信号通路机
制
惠晓丹;朱虹;张昊悦;孙峰;赵蓓
【摘要】ABSTRACT:OBJECTIVE To explore intervention of Gualou Qumai Tang(GLQM) in preventing the development of diabetic nephropathy(DN) through P38MAPK signaling pathway methods.METHODS Except those in the normal group,SD rats of DN model were established by with unilateral nephrectomy and intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)induced produc-tion.Then rats were randomly divided into five groups:the model group,and the four treated groups treated with low dose of GLQM-
L,medium dose of GLQM-M,high dose of GLQM-H,positive medicine (valsartan),The treatments were given via gastrogavage every day starting from the 4th week of modeling,groups treated with high,medium and low dose of GLQM were given via gastrogavage to 5.6,2.8,1.4 g/kg,positive drugs(valsartan)group were given via gastrogavage to 4.8×10 -3 g/kg,the normal group and model group were given 2.8 g/kg distilled water,once a day for 12 weeks.we observed the sign of rats and the rat glomerular,renal tubular structure changes with the optical microscope.Then we observed the sign of rats and the expreion the basic fibroblast growth
factor(bFGF),Insulin-like Growth Factor(IGF),Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1) changes in renal issues of rats by using ELISA.The protein expression of p-p38MPK,p-CREB,FN were immuno-histochemically investigated.The mRNA expressions FN in renal tissue we examined using
qPCR method.The protein expres-sion of p-p38MPK,p-CREB,FN in renal tissue we also examined using Western Blot method.RESULTS The pathologic changes of the renal tissue apparented in the model group.The bFGF,IGF,MCP-1 in renal tissues of rats with model were higher than the nomal group,there were significant difference among the model group
and the norml group(P <0.01).The bFGF,IGF,MCP-1 in renal tissues of rats with GLQM and valsartan were lower than the model group,there were significant difference among them(P <0.05~0.01).The protein expression of p-p38MAPK,p-CREB,FN in renal tissues with model were higher than the normal group(P <0.05~0.01).The mRNA expression of FN in renal tissues
of rats with GLQM were lower than the model group(P <0.05~0.01);the protein expression of p-p38MAPK,p-CREB,FN in renal tissue of rats with GLQM were lower than the model group(P <0.05 ~0.01).CONCLUSION GLQM can reatrain the activation of p38MAPK signaling pathway and be effective in repair and regeneration of the damaged tissue,it is also slow down the process of DN.%目的：研究栝楼瞿麦汤干预糖尿病肾病大鼠
p38MAPK 炎症信号通路的机制,探讨其对糖尿病肾病的作用机制及治疗效果。

方
法通过对 SD 大鼠采用单侧肾切除及一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法构建
大鼠糖尿病肾病(DN)模型。

造模成功后,随机分为：DN 模型组,栝楼瞿麦汤高、中、低剂量组,阳性药物(缬沙坦)组,另设正常组。

治疗组从实验开始第4周起,栝楼瞿麦
汤高、中、低剂量组分别以5.6、2.8、1.4 g/kg ig,缬沙坦4.8×10-3 g/kg ig,正
常组及模型组均给予2.8 g/kg 蒸馏水 ig,每日1次,连续12周。

于末次给药12 h 后,剖杀取大鼠肾组织。

观察大鼠一般情况；光镜观察大鼠肾小球、肾小管组织结
构变化；ELISA 检测大鼠肾组织中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素生长
因子(IGF)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量；Western blot 法检测大鼠肾组织 p-p38、p-CREB、FN 蛋白表达情况。

逆转录聚合酶链反应(qPCR)法检测大鼠肾组织 FNmRNA 基因表达情况。

结果 DN 模型组大鼠与正常组大鼠比较,肾组织
出现明显的病理变化,肾组织中 bF-GF、IGF、MCP-1含量显著升高(P <0.01)；p-p38MAPK、p-CREB、FN 蛋白表达水平显著上调(P <0.05)；FNmRNA 基因表
达水平显著上升(P <0.05)。

经栝楼瞿麦汤干预后,各治疗组与 DN 模型组比较,肾组织病理变化有不同程度的改善；肾组织中bFGF、IGF、MCP-1含量有不同程度的减少,差异具有统计学意义(P <0.05~0.01)；肾组织中 p-p38MAPK、p-CREB、FN 蛋白表达水平下调；FNmRNA 基因表达水平下调,差异具有统计学意义(P
<0.05~0.01)。

结论栝楼瞿麦汤能通过抑制 DN 大鼠肾组织中 p38MAPK 炎症信
号通路的激活,使损伤的组织得以修复,从而延缓 DN 的病理进程。

【期刊名称】《南京中医药大学学报》
【年(卷),期】2017(033)001
【总页数】6页(P59-64)
【关键词】糖尿病肾病;栝楼瞿麦汤;p38MAPK 通路;bFGF;IGF;MCP-1
【作者】惠晓丹;朱虹;张昊悦;孙峰;赵蓓
【作者单位】扬州大学临床医学院，江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，江苏扬州225000;扬州大学临床医学院，江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，江苏扬州 225000;扬州大学临床医学院，江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，江苏扬州 225000;扬州大学临床医学院，江苏省中西医结合老年病防治重点
实验室，江苏扬州 225000;扬州大学临床医学院，江苏省中西医结合老年病防治
重点实验室，江苏扬州 225000
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病严重的微血管并发症，影响大约40%的Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病患者，也是形成慢性肾脏病和肾功能衰竭的主要原因，
可导致财政和医疗负担的加重[1-2]。

目前国内外学者高度认可炎症是作为DN糖
代谢紊乱、血流动力学障碍等发病机制的下游途经。

DN炎性损伤包括炎症因子的高表达及炎症信号通路的激活等，其中p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)炎症信号通路在炎症参与的肾组织病变中起到重要作用[3]。

本研究通过研究GLQM干预DN大鼠p38MAPK炎症信号通路机制，深入探求从中医药的角度防治DN的有效诊疗方法和手段。

1.1 动物
健康SPF级SD大鼠100只，雌雄各半，体质量(198±14) g，购自南通大学实验动物中心，许可证号:SCXK(苏)12014-0001。

1.2 药品及试剂
栝楼瞿麦汤由栝楼根、瞿麦、山药、茯苓、附子、肉桂、益母草、桃仁等药物组成。

药物剂量按《金匮要略》栝楼瞿麦丸方之比例及临床经验总结：栝楼根3∶瞿麦1∶山药3∶茯苓3∶附子1∶肉桂1∶益母草2∶桃仁1。

中药饮片购自江苏省苏北人
民医院中药房，口服液由江苏省中西医结合老年病防治重点实验室制剂：将所有药物水提后，浓缩成含生药2 g/mL,置于250 mL盐水瓶中，4 ℃保存备用。

阳性对照药物以蒸馏水溶解缬沙坦，制成悬浊液，备用。

缬沙坦(北京诺华制药有限公司,批号：X1788)。

链脲佐菌素(STZ, Sigma公司，批号：S0130)。

bFGF试剂盒(艾
德瑞生物科技有限公司DRE20562)，IGF试剂盒(艾德瑞生物科技有限公司
DRE21289)，MCP-1(bioswamp RA20492)试剂盒、全蛋白提取试剂盒
(KGP2100)、Trizol提取试剂盒(ambion15596-026)、反转录试剂盒(TAKARA RR036A)、荧光定量PCR试剂盒(TAKARA RR420A)、p38MAPK(ab170099)、p-p38MAPK(ab47363)、CREB(ab178322)、p-pCREB(ab32096)、β-actin(Cell Signaling公司)，HRP标记的羊抗兔IgG(Bioworld公司)。

1.3 仪器
荧光定量PCR仪(Roch公司)、核酸蛋白测定仪(德国IMPLEN公司)、光学显微镜(日本Olympus公司)、蛋白电泳槽、SDS-PAGE凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad 公司)。

2.1 动物模型的制备
100只SD大鼠购回后适应性饲养1周，参考文献方法[4]将其中94只大鼠以单侧肾切除链脲佐菌素(STZ)诱导制作大鼠糖尿病肾病(DN)模型:大鼠禁食不禁水12 h 以上，常规消毒，10%水合氯醛2 mL/kg腹腔注射麻醉。

背部切口1～1.5 cm，暴露右肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，切除右肾，结扎右肾门血管，缝合切口，用双氧水擦拭切口，外用青霉素干粉涂敷创口。

手术2周后，大鼠按45 mg/kg剂量一次性腹腔注射STZ(STZ溶于0.1 mmol/L的柠檬酸盐溶液，pH 4.2～4.4)。

注射STZ 72 h后，大鼠尾静脉采血1 mL测定血糖。

随机血糖≥16.7 mmol/L者，确定造模成功。

正常组大鼠腹腔注射相应体积的柠檬酸盐溶液。

2.2 分组与给药
取造模成功动物40只，按随机数字法将其分为DN模型组、栝楼瞿麦汤高剂量组(GLQM-H)、栝楼瞿麦汤中剂量组(GLQM-M)、栝楼瞿麦汤低剂量组(GLQM-L)、阳性药物(缬沙坦)对照组。

各治疗组均从实验开始第4周起，每天灌胃给药，GLQM-L、GLQM-M、GLQM-H分别予以1.4、2.8、5.6 g/kg，缬沙坦组
4.8×10-3 g/kg。

每天1次，连续12周。

正常组及模型组均给予2.8 g/kg蒸馏水。

末次给药12 h后，颈椎脱位法处死大鼠，打开腹腔，取出左侧肾脏称质量，
并沿矢状面剖开，取1/2用10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，以便进
行病理组织学分析,另1/2于液氮中保存备用。

2.3 观察指标
2.3.1 肾组织病理形态学观察肾组织经切片后，分别进行HE、PAS染色，封片后用光学显微镜进行观察。

2.3.2 细胞因子检测从液氮中取出备用组织，取其中约100 mg，PBS缓冲液漂洗，除去血液，滤纸拭干，称质量，加入组织块质量9倍的PBS缓冲液，将肾组织研碎，制成10%的肾组织匀浆。

将制备好的肾组织匀浆用低速离心机3 000 r/min
离心15 min，将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀，于-80 ℃保存待用。

采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测bFGF、IGF、MCP-1。

检测方法按试剂盒中提供的操作说明严格进行。

2.3.3 qPCR法检测肾脏组织中FNmRNA的表达取肾组织约100 mg用Trizol法提取总RNA,核酸蛋白定量分析仪测D(260)、D(280),根据D(260)/D(280)值，判断RNA纯度。

按反转录试剂盒说明书操作要求将总mRNA逆转录合成cDNA，
以此为模板，GAPDH为内参用表1中引物(Oligo生物公司)经PCR进行扩增。

扩增条件为：95 ℃预变性600 s。

循环参数：95 ℃变性10 s，不同退火温度退火
10 s，72 ℃延伸，共45个循环。

2.3.4 Western blot法检测大鼠肾组织p-p38、p-CREB、FN蛋白的表达取约100 mg肾组织按全蛋白提取试剂盒说明书操作要求提取总蛋白，用蛋白定量仪进行蛋白浓度测定后，经SDS-PAGE凝胶分离，60 V恒压20 min，110 V恒压电
泳30 min后，将胶上分离的蛋白质电转移到PVDF膜上，TBST洗膜3次，每次15 min。

5%脱脂奶粉TBST溶液室温封闭2 h，TBST洗膜3次，每次15 min。

分别加p38MAPK一抗(1∶2 000)、p-p38MAPK一抗(1∶1 000)、CREB一抗(1∶500)、p-CREB(1∶5 000)、FN一抗于4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次15
min。

加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶2 000)室温下继续孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，采用凝胶成像分析系统检测各蛋白条带。

2.4 统计学分析
采用SPSS16.0统计软件处理，两两比较采用单因素方差分析，计量数据用±s表示。

3.1 一般状态
正常组大鼠的一般状况较好，模型组大鼠出现多饮，多食，多尿，消瘦，精神萎靡等表现，各治疗组大鼠在实验过程中，症状均较DN模型组轻，且体质量增加。

3.2 GLQM对DN大鼠肾组织病理形态的影响
肾组织HE染色显示：与正常组比较，DN模型组大鼠肾小球明显增大，肾小管上皮细胞出现不同程度的空泡样变性，肾间质有大量炎性细胞浸润。

与DN模型组比较，各治疗组的肾小球大小有不同程度的减小，间质炎性细胞的浸润也有不同程度的减轻，病理损伤减轻(见图1)。

肾组织PAS染色显示：正常组大鼠肾组织结构无异常，系膜细胞无增生、细胞外基质无堆积、间质无炎性细胞的浸润；DN模型组大鼠毛细血管腔融合、系膜细胞增生、细胞外基质堆积、出现典型KW结节、肾小球呈弥漫性硬化；经GLQM干预，各治疗组上述病理变化均有不同程度的减轻(见图1)。

3.3 对DN大鼠肾组织bFGF、IGF、MCP-1含量的影响
DN模型组大鼠肾组织bFGF、IGF、MCP-1含量均高于正常组，差异显著
(P<0.01);各治疗组中，栝楼瞿麦汤高、中剂量组bFGF含量,高剂量组MCP-1含量,缬沙坦组大鼠肾组织bFGF含量、IGF含量、MCP-1含量，均低于DN组，有显著性差异(P<0.01)；栝楼瞿麦汤低剂量组bFGF含量、高剂量组IGF含量、中剂量组MCP-1含量，均低于DN组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

3.4 GLQM对DN大鼠肾组织p-p38、p-CREB、FN蛋白表达的影响
Western blot结果显示,正常组p-p38MAPK、p-CREB、FN蛋白水平呈低表达，而DN模型组p-p38MAPK、p-CREB、FN蛋白水平显著上调；经GLQM干预后，各治疗组(GLQM-H尤甚)p-p38MAPK、p-CREB、FN蛋白水平有不同程度的下降；p38MAPK及CREB蛋白表达水平无明显趋势变化(见图2～3)。

3.5 GLQM对DN大鼠肾组织FNmRNA表达的影响
与正常组比较，DN模型组FNmRNA基因表达水平显著上调(P<0.01)；与DN模型组比较，各治疗组FNmRNA基因表达水平有不同程度的下降(P<0.05～
0.01)(见表3)。

糖尿病肾病(DN)的主要病理改变为肾小球肥大、肾小球系膜增宽、基底膜增厚，
肾小管上皮细胞出现空泡样变性、肾小管基底膜增厚等。

本研究采用经典的单侧肾切除及一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法构建大鼠DN模型，HE染色显示
正常组大鼠肾小球无肥大，无炎性细胞的浸润；DN模型组大鼠肾小球明显肥大，肾小管上皮细胞呈空泡样变性，有炎性细胞的浸润。

PAS染色显示正常组大鼠肾
小球结构正常，系膜细胞无增生，细胞外基质无堆积，DN模型组大鼠毛细血管腔融合，系膜细胞增生，细胞外基质大量堆积，出现典型KW结节，肾小球呈弥漫
性硬化，经栝楼瞿麦汤干预后，治疗组大鼠肾小球直径较模型组小、炎性细胞浸润程度减轻、系膜细胞呈轻度增生、细胞外基质堆积情况较DN模型组好转，提示
栝楼瞿麦汤可能对DN损伤的肾组织有一定的修复作用。

研究表明在DN相关病理因素诱导后，肾小球中浸润的巨噬细胞可活化，而后使
其炎症因子高表达，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素生长因子(IGF)、
单核细胞趋化蛋白(MCP-1)等，高表达的炎症因子可诱导磷酸化的p38MAPK(p-
p38MAPK)高表达，活化后的p38MAPK进入到细胞核内，可调控多种核转录因
子如环磷腺苷反应元件连接蛋白(CREB)等，从而激活p38MAPK炎症信号通路，
最终导致细胞外基质的堆积以及肾小球的硬化，而纤维连接蛋白(FN)作为细胞外
基质的主要成分在DN病理状态下高表达。

国内外学者认为，炎症可导致肾小球
硬化，故改善炎症，抑制p38MAPK验证信号通路的激活，可改善DN炎症性的
损伤[5]。

本实验中，大鼠肾组织bFGF、IGF、MCP-1炎症因子的含量较正常组
显著升高(P<0.01)，而经过GLQM干预后，3种细胞因子的含量都有不同程度的
下调。

研究表明，DN发病时，通过破坏肾小球基底膜(GBM)的电荷屏障使滤过功能受损，释放bFGF，促进系膜细胞及细胞外基质(ECM)增生，加速肾小球硬化，而引起蛋白尿和肾功能受损[6]。

本研究显示，DN大鼠肾组织中bFGF水平显著
升高(P<0.01)，而随着栝楼瞿麦汤的运用，由于该方通过温补肾阳、活血化瘀，
达到降低肾小球滤过膜通透性的作用，从而降低大鼠肾组织bFGF水平。

IGF-1是一类主要有肝脏和肾脏分泌的具有胰岛素样代谢作用的促细胞生长因子，能加剧基质体积以及肾脏系膜细胞增生过程，从而导致肾脏肥大以及肾小球高滤过[7-8]。

在DN发病时，IGF在高糖环境下导致基质的堆积以及肾小球血流动力学的改变，使得肾脏分泌IGF量大量增加(P<0.01)。

而栝楼瞿麦汤能通过降低血糖来改善肾
小球微循环，使得肾脏产生的IGF量相对减少。

MCP-1属于趋化因子C-C亚家族中的一员，能够促使单核细胞由外周循环迁移到炎症部位聚集并激活，损伤肾脏组织。

正常肾脏组织分泌少量的MCP-1，对肾脏起一定的保护作用。

DN发病时，
由于持续的高血糖等刺激,造成肾功能不全以及血流动力学紊乱所产生的氧化应激
和炎症[9]。

本研究中，DN模型组MCP-1含量与正常组有明显差异(P<0.01)。

通过栝楼瞿麦汤的应用，各治疗组MCP-1的含量较DN模型组减少(P<0.05～0.01)，提示栝楼瞿麦汤可能对改善肾小球血液供应以及对损伤的组织有一定的修复作用，能通过某些途经下调MCP-1在肾脏的表达。

本研究中，DN模型组p-p38MAPK、p-CREB、FN蛋白水平以及FNmRNA基因表达水平呈高表达，这表明在DN病
理状态下，P38MAPK炎症信号通路处于激活状态，经过GLQM干预后，各治疗
组中p-p38MAPK、p-CREB有不同程度的下调，GLQM-H尤甚，其表达情况接
近缬沙坦组；而本研究中经GLQM干预后，总p38MAPK及CREB蛋白表达水平与DN模型组比较无明显下调趋势，这提示在DN病变时，磷酸化p38MAPK通
路的关键信号分子起重要作用。

经栝楼瞿麦汤干预后，FNmRNA基因表达水平有不同程度的下调(P<0.05～0.01)，而FN蛋白表达水平也随之下调。

提示GLQM
在体内具有抑制炎症细胞浸润和炎症因子表达，减轻肾组织炎症性损伤的作用；GLQM通过下调肾组织p38MAPK信号通路中关键信号分子p-p38MAPK、p-creb蛋白表达水平，抑制炎症信号通路活性，减少FNmRNA的表达，从而调控FN蛋白的表达，减少细胞外基质的积聚，改善肾组织炎症性损伤。

中医学认为，DN属消渴、虚劳之范畴。

消渴之病机乃阴虚燥热。

本病日久，阴损及阳而累及肾阳，出现下寒上燥证。

且久病入络，血脉瘀滞。

瘀血是消渴病及其慢性并发症的主要病理基础，贯穿于消渴病及其慢性并发症的全过程。

栝楼瞿麦汤由栝楼根、瞿麦、山药、茯苓、附子、肉桂、益母草、桃仁等组成。

方中栝楼根润燥生津；山药甘淡健脾利水。

现代药理研究指出，山药具有降血糖作用。

茯苓、瞿麦淡渗利水，药理学研究指出，茯苓含茯苓聚糖，茯苓酸、蛋白质和卵磷脂等，有利尿和降低血糖的作用。

瞿麦具有利尿通淋，破血通经的作用，药理研究表明，瞿麦富含维生素A类物质、糖类、皂苷和少量生物碱，有显著的利尿作用，能够影响
肾容积。

肉桂、附子温阳化气。

药理学研究证实，肉桂具有扩张血管的作用，可以增强血液循环。

方中又加入活血之益母草、桃仁，现代药理学证实，益母草具有促进微动脉血流恢复的作用，使闭塞的毛细血管重新开放，通过改善肾内血流动力学，起保护肾脏的作用。

桃仁具有纤溶促进、改善血液流变学的作用。

诸药合用具有温阳通气、润燥生津、化瘀利水之功效，可使机体的气化功能恢复正常，则血和津液的运行、输布以及代谢正常，从而改善肾脏微循环，使损伤的组织得以修复和再生。

DN大鼠在应用栝楼瞿麦汤后，一定程度上抑制P38MAPK通路，对损伤的组织
起到一定的修复作用。

但低剂量治疗组与高剂量、中剂量与缬沙坦组比较，作用效
果不明显。

因此，运用栝楼瞿麦汤治疗DN的作用机制还有待进一步研究。

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