猪丹毒杆菌的分离及鉴定

动物科学现代农业科技2012年第4期
猪丹毒（Swine Erysipelas，SE）也叫钻石皮肤病（diamond skin disease）或红热病（red fever），是由红斑丹毒丝菌（Ery-sipelothrix rhusiopathiae）引起的一种急性、热性传染病[1]。

临床与剖检特征为高热、急性败血症、亚急性疹块性和慢性疣状心内膜炎及多发性非化脓性关节炎[2]。

该病呈世界性广泛分布，是影响欧洲、亚洲、澳洲和美洲大陆经济的一种重要疾病[1]。

猪丹毒杆菌所引起的猪丹毒病广泛流行于世界各地，为我国主要的猪传染病之一，对养猪业造成严重的经济损失。

该试验按常规方法从疑似病例中采集病料，经常规分离培养及生化鉴定、动物试验，确诊为猪丹毒病。

1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1病料来源。

病料来自昆明地区某猪场，疑似猪丹毒病死猪，采用无菌手续采取脾脏等组织备用。

1.1.2生化试剂。

葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、菊糖、D-甘露糖、木糖、鼠李糖、木糖、靛基质、M.R.、V-P、H2S、尿素、明胶、枸橼酸盐斜面、过氧化氢等。

1.1.3培养基。

鲜血琼脂培养基、马丁肉汤、马丁肉汤琼脂培养基。

按常规方法制备备用。

1.1.4试验设备。

小试管、培养皿、超净工作台、恒温培养箱、电子分析天平、生物显微镜、高压灭菌锅、低温冰箱等，均由云南农业大学动物医学实验教学中心预防兽医学实验室提供。

1.1.5试验动物。

ICR系20日龄健康小白鼠17~20g，2只，购自昆明医学院；家鸽2只，兔子4只，均购自昆明市盘龙区龙头街市场。

1.2试验方法
1.2.1病原分离培养。

无菌取肝、脾、淋巴结等病料分别接种于鲜血琼脂培养基，37℃培养24~48h后，挑取可疑菌株再接种于马丁肉汤琼脂培养基作纯培养和生化试验鉴定[3]。

1.2.2分离菌株鉴定。

具体步骤如下：①镜检。

将分离菌株纯培养物直接涂片，火焰固定后革兰氏染色，镜检。

②糖发酵试验。

将分离菌株按常规方法分别接种于葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、菊糖、棉籽糖、鼠李糖、D-甘露糖、木糖半固体培养基，37℃培养24~48h，观察其对糖的利用情况并记录结果。

根据指示剂的变化判断待检菌，若产酸则培养基变黄，为阳性反应，以“+”表示；如果产酸、产气，以“⊕”表示；若指示剂没有变化，用“-”表示。

③尿素酶试验。

将分离菌株划线接种于尿素酶培养基斜面上，37℃培养24~48h，观察其反应情况。

培养基变粉红色至红色者为阳性反应，不变者为阴性反应。

④枸橼酸盐利用试验。

将分离菌株划线接种于枸橼酸盐培养基斜面上，37℃培养24~48h，观察其对有机酸盐的利用情况。

培养基变成深蓝色者为阳性反应，不变者为阴性反应[4]。

⑤靛基质（Imdole）试验（吲哚试验）。

将分离菌株接种于蛋白胨水培养基中，37℃培养72h后，先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁缓缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈玫瑰红者为阳性反应，反之为阴性反应。

⑥M.R.（Methyl Red）试验。

将分离菌株接种于甲基红试验培养基，37℃培养72h后，滴加甲基红试剂3~4滴，观察其反应情况。

阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，不变色为阴性。

⑦V-P 试验。

将分离菌株接种于V-P培养基，37℃培养24~72h，将甲液（5%α—萘酚溶液）2~3滴加入试管中，摇混均匀，再加入40%氢氧化钾2~3滴，再摇混均匀。

阳性反应立即或15min 内呈现红色，阴性反应为铜色。

阴性结果在1h后再做一次检查。

有些试管在数小时后红色会逐渐消失，此仍作阳性反应。

⑧H2S产生试验。

将分离菌株沿管壁穿刺接种醋酸铅琼脂培养基，37℃培养24~72h，观察其反应情况。

培养基变黑者为阳性反应，反之为阴性反应。

⑨硝酸盐（Nitrate）还原试验。

临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）试液各0.2mL等量混合，取混合试剂约0.1mL加入液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。

用α-萘胺乙醇进行试验时，阳性红色消褪很快，故加入后应立即判定结果。

进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。

⑩过氧化氢酶试验。

在玻璃板滴新鲜配制的3%过氧化氢水溶液1滴，挑取培养18~24h的菌苔1环，在H2O2溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。

也可将过氧化氢溶液直接加入斜面上，观察气泡的产生。

輥輯訛明胶穿刺试验。

将可疑菌落以较大量穿刺接种于明胶培养基中，常温下培养4~7d，观察细菌沿穿刺线的生长情况。

1.2.3动物试验。

具体如下：①分别将细菌肉汤培养物小白
猪丹毒杆菌的分离及鉴定
朱凤琼1陈达燕2夏英杰3张云波3杨贵树4*
（1云南省陆良县动物疫病预防控制中心，云南陆良655600；2云南省昭通农业学校；3呈贡县畜牧兽医站；4云南农业大学动物科学技术学院）
摘要猪丹毒主要是由丹毒杆菌属红斑丹毒丝菌引起的主要危害猪的一种急性、热性传染病。

临床与剖检特征为高热、急性败血症、亚急性疹块型和慢性疣状心内膜炎及多发性非化脓性关节炎。

该病的流行有明显的季节性，多发生于夏季，5—8月是流行的高峰期，其他月份仅有零星发生。

该病呈世界性广泛分布，是欧洲、亚洲、澳洲和美洲大陆经济上重要的一种疾病，为我国三大猪传染病之一，给养猪业造成严重的经济损失。

该试验从疑似猪丹毒病例病料中，采用常规分离培养法进行分离培养，对分离菌株进行生化试验鉴定、明胶穿刺培养试验和动物接种试验鉴定，结果分离菌株为猪丹毒杆菌，从而将此病例确诊为猪丹毒，为养殖场防治该病提供理论依据。

关键词猪丹毒；病原；分离；鉴定
中图分类号S852.61文献标识码A文章编号1007-5739（2012）04-0316-02
*通讯作者
收稿日期2011-12-30
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鼠腹腔注射0.2mL ，家鸽胸肌1mL ，兔子皮下注射1.5mL ，连续观察2周，记录试验结果。

②采集病死小白鼠和家鸽的肝脏进行病原的分离培养及鉴定试验，并与分离菌株对照分析。

2结果与分析2.1
培养特性
24h 后鲜血琼脂培养基上有白色小露滴状菌落，并有
溶血圈。

马丁肉汤琼脂培养基上有菌落纤细、针尖大露珠样、透明、圆形、中部稍凸起、表面光滑、边缘整齐、直径为1~
2mm 的菌落，与猪丹毒杆菌菌落相符合。

2.2分离菌株鉴定
2.2.1
分离菌株涂片镜检结果。

革兰氏染色无荚膜，不产生
芽孢，不运动；长0.20~0.40μm 、宽0.50~0.25μm ；革兰氏染色为阳性，与猪丹毒杆菌染色特性相符（图1）。

2.2.2
生化试验鉴定结果。

分离菌株能发酵葡萄糖、果糖和
乳糖，产酸不产气，不发酵蔗糖、麦芽糖、菊糖、D －甘露糖、木糖、鼠李糖、木糖，能产生H 2S ，不产生靛基质，不分解尿素，不还原硝酸盐为亚硝酸盐，M.R.及V-P 试验阴性，过氧化氢酶阴性（表1）。

由此可以看出，分离菌株生化特性与猪丹毒杆菌相符。

2.2.3明胶培养基穿刺试验结果。

明胶穿刺时，细菌沿穿刺线向四周生长，呈试管刷状，明胶不液化。

2.3
动物试验结果
接种疑似菌株后，2只小白鼠和2只鸽子相继病发死
亡，2只兔子健康存活。

病料涂片镜检发现，将小白鼠和鸽子病料直接涂片染色镜检，可见大量纤细的革兰氏阳性杆菌（图2、3）。

将死亡小白鼠和鸽子的肝脏组织分别接种于马丁肉汤琼脂培养基上进行常规划线分离。

37℃培养24h 后，挑取菌落经涂片固定后，革兰氏染色镜检，可见疑似菌体。

经生化
试验及菌株鉴定，与原分离菌株相符。

3
结论与讨论
猪丹毒杆菌生命力顽固，其表面有一层蜡样物质，对盐
腌、火熏、干燥、腐败和日光等自然环境的抵抗力较强，在病死猪的肝、脾内（4℃，159d ）毒力仍然很强大。

将露天放置
77d 的病死猪肝脏，深埋1.5m ，或将231d 的病猪尸体，经12%食盐处理并冷藏于4℃的猪肉中148d ，都可以分离出
猪丹毒杆菌。

其在弱碱性土壤中可生存90d ，最长可达14个月。

因此，土壤污染在该病的流行病学上有极其重要的意义。

目前，血清学的诊断方法主要适用于亚急性和慢性的诊断，由于急性型发病快，死亡率高，对急性败血型的诊断
意义不大。

血清学诊断方法：血清培养凝集试验（ESCA ），又称生长凝集试验，根据猪丹毒杆菌在生长繁殖中能与该菌抗血清发生特异性凝集设计，可用于该病的检测和血清抗体水平的评价；SPA 协同凝集试验，可用于该菌的鉴别和菌株分型；琼扩试验，既可检测也可用于菌株血清型的鉴定；免疫荧光抗体可用作快速诊断，直接检查病料中的猪丹毒杆菌[5]。

急性败血型丹毒应注意与猪瘟、猪肺疫、猪链球菌病和李氏杆菌病等相区别。

完整的血清分型费时、费力，由于该试验受试验条件及经费的限制，猪丹毒病的诊断从临床症状、病理解剖变化再结合生化鉴定及动物试验即可做出确诊。

4参考文献
[1]B E 斯特劳，S D 阿莱尔，W L 蒙加林，等.猪病学[M].赵德明，张中
秋，沈建忠，等，译.北京：中国农业出版社，2000：432-443.
[2]宣长.猪病学[M].2版.北京：中国农业科学技术出版社，2003：108-119.[3]费恩阁，李德昌，丁壮.动物疫病学[M].北京：中国农业出版社，2004：
83-88.
[4]D C 赫什，N J 麦克劳克伦，R L 沃克.兽医微生物学[M].王凤阳，范泉
水，译.北京：科学出版社，2007：271-277.
[5]陈溥言.兽医传染病学[M].5版.北京：中国农业出版社，2006：245-249.
注：“+”表示产酸，“-”表示阴性，“⊕”表示产酸、产气。

表1
猪丹毒杆菌生化试验结果
项目结果
项目结果
葡萄糖+木糖
-乳糖+硝酸盐还原-果糖+靛基质
-蔗糖
-M.R.-
D－
甘露糖
-V-P -麦芽糖-过氧化氢酶
-棉籽糖-H 2S
+鼠李糖-尿素酶
-菊糖
-
枸橼酸盐斜面
-
图1
马丁肉汤琼脂培养物（100×16倍，革兰氏染色）图2小白鼠肝脏触片（100×16倍，革兰氏染色）
图3鸽子肝脏触片（100×16倍，革兰氏染色）
朱凤琼等：猪丹毒杆菌的分离及鉴定
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