多年生黑麦草P5CS基因的定点突变及其在拟南芥中的转化
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和 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｒ检 测 ， 得 ４ 转 基 因阳 性株 系 。拟 南 芥 Ｔ Ｃ 获 个 代 植 株 经 １ ０ｍｍｏ／ ０ ｌ Ｎａ １ 理 ７ ｄ后 ， 基 因 株 系 脯 Ｉ Ｃ 处 转 氨酸 含 量 分 别 为 ４ ２ ２ ５６ ３￣ ， ｗ ， 著 高 于 野 生 型株 系 的 ２５ １ ｇ ｇＦ 。说 明 转基 因株 系能 积 累 更 多 地 ６ 和 ２ ｇ ｇＦ 显 ／ ８ ｗ
因， 多年生黑 麦草 Ｐ Ｃ 将 ５ Ｓ蛋 白上 １ ８ 的 Ｐ ｅ 点 突 变 为 Ａｌ， 用 双 酶 切 方 法 构 建 了 多 年 生 黑 麦 草 （ ｏｉｍ ２位 ｈ 定 ａ采 Ｌｌ ｕ
ｐ ｒｎ ｅ Ｐ Ｃ Ｆ１ ８ ｅｅｎ ） ５ Ｓ ２ Ａ基 因真核 表达载体 ， 并通过农 杆菌 ＧＶ３ ０ １ １介导 ， Ｌ Ｐ Ｃ Ｆ１ ８ 基 因转入 拟南 芥 （ — 将 ｐ ５ Ｓ ２Ａ Ａｔ
（ ． 国农 业 大 学 观赏 园 艺 与 园林 系 ， 京 １ ０ ９ ； ． 国林 业 科 学研 究 院 林 业 研究 所 ／ １中 北 ０ １ ３２ 中 国家 林 业 局林 木 培 育 重 点 实验 室 ． 京 １ ０ ９ ； ． 国科 学 院成 都 生 物 研究 所 ， Ｉ 成都 ６ ０ ４ ） 北 ０ ０ １３ 中 四川 １ ０ １
脯氨酸 。
关 键 词 ： 年 生 黑 麦草 ； 点 突变 技 术 ； 氨 酸 合 成 酶基 因 ； 杆 菌 转 化 多 定 脯 农 中 图分 类 号 ： ５ ３ ． ０ ． ３ Ｑ９ ３ ２ ￥ ４ 一 ６ ３ ５ ； ４ ． 文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ ４５ ５ （ ０ １ ０ — ２ ２ ０ １ ０ — ７ ９ ２ １ ） １０ ４ — ６
２ — ２７ ４２ ４
草 业 学 报
ＡＣＴＡ ＰＲＡＴ ＡＣＵ ＬＴＵ ＲＡ Ｅ Ｎ Ｉ ＳＩ ＣＡ
第 ２ Ｏ卷
第 １期
２１ ０ １年 ２月
Ｖｏ１２０， ． Ｎｏ． １
多年 生黑 麦草 Ｐ Ｃ Ｓ Ｓ基 因 的 定 点 突 变 及 其 在 拟 南 芥 中 的 转 化
曹 丽 ， 鸣放 ， 义 孙振 元 ， 蕾 巨关升 马 欣 荣。 韩 ， ，
Ｖａ ５ Ｓ上 的 １ ９ 的 苯 丙 氨 酸 （ ｈ ｎ ｌｌｎｎ ， 称 Ｐ ｅ Ｆ 突 变 为 丙 氨 酸 （ ａ ｉｅ Ａｌ） Ｖａ ５ Ｓ的 反 馈 ＰＣ ２ 位 Ｐ ｅ ｙａａ ｉｅ简 ｈ 或 ） Ａｌｎｎ ， ａ 后 ＰＣ
抑制 被 消 除 ， 氨 酸 对 Ｐ Ｃ 脯 ５ Ｓ活 性 ５ 的 抑 制 量 从 野 生 型 ６ ｍｍｏ／ 提 高 到 突 变 型 Ｐ Ｃ Ｆ ２ Ａ 的 ９ ０ ０ ｌＬ ５ Ｓ １９ ６ ｍｍｏ／ 转突变 Ｐ Ｃ ｌＬ， ５ Ｓ基 因 的烟 草（ ｃｔ ｎ ｂ ｃｍ） Ｎｉ ｉ ａｔ ａ ｕ 个体 脯 氨 酸含量 是 转 野生 型 Ｐ Ｃ ｏａ ａ ５ Ｓ基 因的 ２倍 还 多 ， 一 在 干旱和盐胁 迫条件 下 ， 的生长 量增加并 促进 了花 的发 育 。证 明 Ｐ Ｃ 根 ５ Ｓ的反 馈调 节 在控 制植 物脯 氨酸 水平 上
扮 演 着 重 要 的 角 色 。
中 国林业 科学研 究院林业 研究所 生理生化 实验室 将 Ｌ Ｐ５ Ｓ与其他植 物 的同源基 因进行 比对和 分析后 ， ｐ Ｃ 推 测 Ｌ ＰＣ ｐ Ｓ Ｓ蛋 白上 １ ８位的 Ｐ ｅ ２ ｈ 是这个 基因 的反馈抑制 位点 。基于此 ， 笔者 以先前 克 隆的 Ｌ Ｐ５ Ｓ基 因为靶基 ｐ Ｃ
摘 要 ： 前期 克隆 获 得 Ｌ Ｐ Ｃ 在 ｐ ５ Ｓ基 因 的全 长 ｃ ＮＡ 序列 基 础 上 ， 用 Ｐ Ｒ 扩增 技 术 对 多 年 生 黑 麦 草 脯 氨 酸 合 成 酶 Ｄ 采 Ｃ 基 因 Ｐ５ Ｓ的定 点 突 变 体 系进 行 了探 讨 ， 运 用农 杆 菌 转 化 技 术 对 突 变 后 的 基 因 进 行 了功 能 验 证 。 根 据 突 变 位 点 Ｃ 并 序 列设 计 一 对 引 物 ， 用 Ｐ ｕ高 保 真 Ｄ Ａ 聚 合 酶 和 超 级 感 受 态 细 胞 ＤＭＴ， 过 Ｐ Ｒ 扩 增 ， 得 含 有 所 要 突 变 位 使 ｆ Ｎ 通 Ｃ 获 点 的 Ｌ Ｐ５ Ｓ １ ８ 定 向克 隆 入 真 核 表达 载 体 ｐ ＡＭＢ Ａ１ ０ ｐ Ｃ Ｆ ２ Ａ， Ｃ Ｉ ３ ０中 ， 化 拟 南 芥 验 证 基 因功 能 。结 果 表 明 ， 期 位 转 预
△Ｌ吡咯啉一一 酸合成 酶 （ ５ Ｓ 是双 功能 酶 ， 化植 物 中 经谷 氨酸 合成 脯 氨 酸 的前 ２步 反应 ， 迫 条件 下 ５羧 ＰＣ ） 催 胁 脯 氨酸 的合 成不仅受 Ｐ Ｃ ５ Ｓ转录激 活的调节 ， 受到该途 径终产 物脯 氨酸 的反 馈抑 制［ 也 １。Ｈｏ ｇ等 研 究表 明 ， ｎ
点上 发 生 了突 变 ， ｐ ５ Ｓ编码 的第 １８位 密码 子 已 由苯 丙 氨 酸残 基 （ ｈｎ ｌａ ｉｅ简 称 Ｐ ｅ Ｆ 变 为 丙 氨 酸 残 Ｌ ＰＣ ２ Ｐ ｅｙａ ｎｎ ， ｌ ｈ或 ） 基 （ ｌｎｎ ， ａ ， 明用 Ｐ Ｒ技 术 已 成 功地 使 Ｌ Ｐ Ｃ Ａ ａｉｅＡｌ）证 Ｃ ｐ ５ Ｓ基 因发 生 定 点 突 变 。转 基 因 拟 南 芥 Ｔ 代 植 株 进 行 Ｐ Ｒ Ｃ
ａ ｉｏ ｓ ａ ｉｎ ） ， 对其进 行初步 的功能鉴定 ， 采用遗传 工程 手段创制 抗逆性 草 坪草 品种 提供参 考依据 。 ｂｄ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ 中 并 ｓｈ ａ 为
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
本实验 于 ２ ０ —２ １ ０ ９ ０ ０年在北京 进行 ， 生拟 南芥 （ ｏｕ ｉ） 表达 载 体 ｐ ＡＭＢ Ａ１ ０ 野 Ｃ ｌｍｂａ 、 Ｃ Ｉ ３ ０质 粒 、 癌农 杆菌 根
因， 多年生黑 麦草 Ｐ Ｃ 将 ５ Ｓ蛋 白上 １ ８ 的 Ｐ ｅ 点 突 变 为 Ａｌ， 用 双 酶 切 方 法 构 建 了 多 年 生 黑 麦 草 （ ｏｉｍ ２位 ｈ 定 ａ采 Ｌｌ ｕ
ｐ ｒｎ ｅ Ｐ Ｃ Ｆ１ ８ ｅｅｎ ） ５ Ｓ ２ Ａ基 因真核 表达载体 ， 并通过农 杆菌 ＧＶ３ ０ １ １介导 ， Ｌ Ｐ Ｃ Ｆ１ ８ 基 因转入 拟南 芥 （ — 将 ｐ ５ Ｓ ２Ａ Ａｔ
（ ． 国农 业 大 学 观赏 园 艺 与 园林 系 ， 京 １ ０ ９ ； ． 国林 业 科 学研 究 院 林 业 研究 所 ／ １中 北 ０ １ ３２ 中 国家 林 业 局林 木 培 育 重 点 实验 室 ． 京 １ ０ ９ ； ． 国科 学 院成 都 生 物 研究 所 ， Ｉ 成都 ６ ０ ４ ） 北 ０ ０ １３ 中 四川 １ ０ １
脯氨酸 。
关 键 词 ： 年 生 黑 麦草 ； 点 突变 技 术 ； 氨 酸 合 成 酶基 因 ； 杆 菌 转 化 多 定 脯 农 中 图分 类 号 ： ５ ３ ． ０ ． ３ Ｑ９ ３ ２ ￥ ４ 一 ６ ３ ５ ； ４ ． 文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ ４５ ５ （ ０ １ ０ — ２ ２ ０ １ ０ — ７ ９ ２ １ ） １０ ４ — ６
２ — ２７ ４２ ４
草 业 学 报
ＡＣＴＡ ＰＲＡＴ ＡＣＵ ＬＴＵ ＲＡ Ｅ Ｎ Ｉ ＳＩ ＣＡ
第 ２ Ｏ卷
第 １期
２１ ０ １年 ２月
Ｖｏ１２０， ． Ｎｏ． １
多年 生黑 麦草 Ｐ Ｃ Ｓ Ｓ基 因 的 定 点 突 变 及 其 在 拟 南 芥 中 的 转 化
曹 丽 ， 鸣放 ， 义 孙振 元 ， 蕾 巨关升 马 欣 荣。 韩 ， ，
Ｖａ ５ Ｓ上 的 １ ９ 的 苯 丙 氨 酸 （ ｈ ｎ ｌｌｎｎ ， 称 Ｐ ｅ Ｆ 突 变 为 丙 氨 酸 （ ａ ｉｅ Ａｌ） Ｖａ ５ Ｓ的 反 馈 ＰＣ ２ 位 Ｐ ｅ ｙａａ ｉｅ简 ｈ 或 ） Ａｌｎｎ ， ａ 后 ＰＣ
抑制 被 消 除 ， 氨 酸 对 Ｐ Ｃ 脯 ５ Ｓ活 性 ５ 的 抑 制 量 从 野 生 型 ６ ｍｍｏ／ 提 高 到 突 变 型 Ｐ Ｃ Ｆ ２ Ａ 的 ９ ０ ０ ｌＬ ５ Ｓ １９ ６ ｍｍｏ／ 转突变 Ｐ Ｃ ｌＬ， ５ Ｓ基 因 的烟 草（ ｃｔ ｎ ｂ ｃｍ） Ｎｉ ｉ ａｔ ａ ｕ 个体 脯 氨 酸含量 是 转 野生 型 Ｐ Ｃ ｏａ ａ ５ Ｓ基 因的 ２倍 还 多 ， 一 在 干旱和盐胁 迫条件 下 ， 的生长 量增加并 促进 了花 的发 育 。证 明 Ｐ Ｃ 根 ５ Ｓ的反 馈调 节 在控 制植 物脯 氨酸 水平 上
扮 演 着 重 要 的 角 色 。
中 国林业 科学研 究院林业 研究所 生理生化 实验室 将 Ｌ Ｐ５ Ｓ与其他植 物 的同源基 因进行 比对和 分析后 ， ｐ Ｃ 推 测 Ｌ ＰＣ ｐ Ｓ Ｓ蛋 白上 １ ８位的 Ｐ ｅ ２ ｈ 是这个 基因 的反馈抑制 位点 。基于此 ， 笔者 以先前 克 隆的 Ｌ Ｐ５ Ｓ基 因为靶基 ｐ Ｃ
摘 要 ： 前期 克隆 获 得 Ｌ Ｐ Ｃ 在 ｐ ５ Ｓ基 因 的全 长 ｃ ＮＡ 序列 基 础 上 ， 用 Ｐ Ｒ 扩增 技 术 对 多 年 生 黑 麦 草 脯 氨 酸 合 成 酶 Ｄ 采 Ｃ 基 因 Ｐ５ Ｓ的定 点 突 变 体 系进 行 了探 讨 ， 运 用农 杆 菌 转 化 技 术 对 突 变 后 的 基 因 进 行 了功 能 验 证 。 根 据 突 变 位 点 Ｃ 并 序 列设 计 一 对 引 物 ， 用 Ｐ ｕ高 保 真 Ｄ Ａ 聚 合 酶 和 超 级 感 受 态 细 胞 ＤＭＴ， 过 Ｐ Ｒ 扩 增 ， 得 含 有 所 要 突 变 位 使 ｆ Ｎ 通 Ｃ 获 点 的 Ｌ Ｐ５ Ｓ １ ８ 定 向克 隆 入 真 核 表达 载 体 ｐ ＡＭＢ Ａ１ ０ ｐ Ｃ Ｆ ２ Ａ， Ｃ Ｉ ３ ０中 ， 化 拟 南 芥 验 证 基 因功 能 。结 果 表 明 ， 期 位 转 预
△Ｌ吡咯啉一一 酸合成 酶 （ ５ Ｓ 是双 功能 酶 ， 化植 物 中 经谷 氨酸 合成 脯 氨 酸 的前 ２步 反应 ， 迫 条件 下 ５羧 ＰＣ ） 催 胁 脯 氨酸 的合 成不仅受 Ｐ Ｃ ５ Ｓ转录激 活的调节 ， 受到该途 径终产 物脯 氨酸 的反 馈抑 制［ 也 １。Ｈｏ ｇ等 研 究表 明 ， ｎ
点上 发 生 了突 变 ， ｐ ５ Ｓ编码 的第 １８位 密码 子 已 由苯 丙 氨 酸残 基 （ ｈｎ ｌａ ｉｅ简 称 Ｐ ｅ Ｆ 变 为 丙 氨 酸 残 Ｌ ＰＣ ２ Ｐ ｅｙａ ｎｎ ， ｌ ｈ或 ） 基 （ ｌｎｎ ， ａ ， 明用 Ｐ Ｒ技 术 已 成 功地 使 Ｌ Ｐ Ｃ Ａ ａｉｅＡｌ）证 Ｃ ｐ ５ Ｓ基 因发 生 定 点 突 变 。转 基 因 拟 南 芥 Ｔ 代 植 株 进 行 Ｐ Ｒ Ｃ
ａ ｉｏ ｓ ａ ｉｎ ） ， 对其进 行初步 的功能鉴定 ， 采用遗传 工程 手段创制 抗逆性 草 坪草 品种 提供参 考依据 。 ｂｄ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ 中 并 ｓｈ ａ 为
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
本实验 于 ２ ０ —２ １ ０ ９ ０ ０年在北京 进行 ， 生拟 南芥 （ ｏｕ ｉ） 表达 载 体 ｐ ＡＭＢ Ａ１ ０ 野 Ｃ ｌｍｂａ 、 Ｃ Ｉ ３ ０质 粒 、 癌农 杆菌 根