基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法与制作流程

本技术公开了一种基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法。

它包括a、将环境样品进行一定预处理，然后对环境样品进行梯度稀释；b、将不同稀释度环境样品接入含有偶氮染料的孔板培养体系中，经密封后，放入厌氧工作站中培养；c、选择高稀释度样品中具有偶氮染料脱色能力的样品于血清瓶中扩大培养；d、将血清瓶中的菌液进行稀释并涂布于偶氮染料固体培养基上；e、选取偶氮染料固体培养基上能使偶氮染料脱色的单菌落，纯化得到纯菌；f、将得到的纯菌接入到微生物燃料电池的阳极室，测试其产电能力，筛选出产电微生物。

该方法操作简单，成本低，可以快速、高通量对产电微生物进行筛选。

技术要求
1.一种基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将采集获得的环境样品进行预处理，去除样品中较大的杂质颗粒，并对环境样品进行梯度稀释；
b、将不同稀释度环境样品接入含有偶氮染料的孔板培养体系中，经密封后，放入厌氧工作站中培养；
c、选择高稀释度样品中具有偶氮染料脱色能力的样品于血清瓶中扩大培养；
d、将血清瓶中的菌液进行稀释并涂布于偶氮染料固体培养基上；
e、选取偶氮染料固体培养基上能使偶氮染料脱色的单菌落，纯化得到纯菌；
f、将得到的纯菌接入到微生物燃料电池的阳极室，测试其产电能力，筛选出产电微生物。

2.根据权利要求1所述的基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法，其特征在于，所述的孔板培养体系中的孔板是96孔板。

3.根据权利要求1或2所述的基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法，其特征在于，所述的含有偶氮染料的孔板培养体系和血清瓶中的培养基为偶氮染料培养基，其配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.5—1.0g/L、乙酸钠：0.83—1.66g/L和、苋菜红：0.06—
0.10g/L或甲基橙：0.10—0.15g/L，溶剂为水。

4.根据权利要求3所述的基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法，其特征在于，所述的偶氮染料固体培养基是在偶氮染料培养基的基础上加有常量的琼脂。

5.根据权利要求1或2所述的基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法，其特征在于，所述的放入厌氧工作站中培养，厌氧工作站的温度保持在30—37℃。

6.根据权利要求1或2所述的基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法，其特征在于，所述的微生物燃料电池为双室微生物燃料电池，其阳极室的培养基的配方为：十二水合磷酸氢二钠：1
7.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：
1g/L、酵母提取物：0.5—1.0g/L、乙酸钠：0.83—1.66g/L，溶剂为水；其阴极室的培养基的配方为：铁氰化钾：13.17—16.46g/L，溶剂为水。

7.根据权利要求1或2所述的基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法，其特征在于，所述的双室微生物燃料电池，阴阳两极的电极材料均为石墨板，阴阳两极通过钛丝相连接，中间串联电阻，通过连接数据采集器和电脑来检测电流的产生。

技术说明书
一种基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法
技术领域：
本技术涉及产电微生物筛选领域，具体涉及一种基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法。

背景技术：
产电微生物(也可称作胞外产电菌，阳极呼吸菌)是指能够将代谢产生的电子传递到细胞外的电子受体的一类具有胞外电子传递功能的微生物，多为厌氧微生物或兼性厌氧微生物。

产电微生物广泛分布于土壤、水体、沉积物等环境中。

这些微生物参与了多种重要的元素循环过程，在污染治理、生物能源和绿色化工等方面展现出广阔的应用前景。

为了更好地了解产电微生物的种类及其功能活性特点，近年来科学家建立了多种产电微生物的筛选方法，但这些方法普遍存在耗时长、成本高、操作繁琐、通量较低的问题，亟需创新产电微生物筛选方法。

技术内容：
本技术的目的是提供一种快速、高通量、低成本的筛选产电微生物的方法，以期提高产电微生物资源的获取效率。

本技术的基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
a、将采集获得的环境样品进行一定的预处理(如过筛处理，100目的筛子)，去除其中较大的杂质颗粒，并用无菌水对环境样品进行梯度稀释；
b、将不同稀释度环境样品接入含有偶氮染料的孔板培养体系中，经密封后，放入厌氧工作站中培养；
c、选择高稀释度样品中具有偶氮染料脱色能力的样品于血清瓶中扩大培养；
d、将血清瓶中的菌液进行稀释并涂布于偶氮染料固体培养基上；
e、选取偶氮染料固体培养基上能使偶氮染料脱色的单菌落，纯化得到纯菌；
f、将得到的纯菌接入到微生物燃料电池的阳极室，测试其产电能力，筛选出产电微生物。

所述的含有偶氮染料的孔板培养体系和血清瓶中的培养基为偶氮染料培养基，其配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.5—1.0g/L、乙酸钠：0.83—1.66g/L和、苋菜红：0.06—0.10g/L 或甲基橙：0.10—0.15g/L，溶剂为水。

所述的孔板培养体系中的孔板是96孔板，以96孔板作为培养基材，在96孔板中加入培养基作为培养体系。

所述的偶氮染料固体培养基是在偶氮染料培养基的基础上加有常量的琼脂，例如10～
15g/L的琼脂，具体配方可以为十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：
3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.5—1.0g/L、乙酸钠：0.83—1.66g/L、琼脂10～15g/L和、苋菜红：0.06—0.10g/L或甲基橙：0.10—0.15g/L，溶剂为水。

所述的放入厌氧工作站中培养，厌氧工作站的温度保持在30—37℃。

所述的微生物燃料电池为双室微生物燃料电池，其阳极室的培养基的配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.5—1.0g/L、乙酸钠：0.83—1.66g/L，溶剂为水；其阴极室的培养基的配方为：铁氰化钾：13.17—16.46g/L，溶剂为水。

所述的双室微生物燃料电池，阴阳两极的电极材料均为石墨板，阴阳两极通过钛丝相连接，中间串联电阻，通过连接数据采集器和电脑来检测电流的产生。

本技术提供了一种基于偶氮染料脱色活性的产电微生物快速筛选方法，根据产电微生物能够将胞外的偶氮染料还原这一原理，通过含偶氮染料的培养基在96孔板上对产电微生物进行富集，并选取具有偶氮还原能力的样品进行扩大培养，之后通过含偶氮染料的固体培养基对扩大培养后的微生物进行分离纯化，再通过双室微生物燃料电池对纯化的微生物进行产电筛选。

该方法操作简单，成本低，可以实现快速、高通量对产电微生物进行筛选。

附图说明：
图1为本技术实施例中1所述的产电菌RX1的产电图；
图2为本技术实施例中1所述的产电菌RX1的透射电镜图。

具体实施方式：
下面结合实施例对本技术作进一步说明。

实施例旨在对本技术进行举例描述，而非以任何形式对本技术进行限制。

实施例1
1、将环境样品(河流沉积物)进行过筛(100目)处理，以去除样品中较大的杂质颗粒。

然后取适量环境样品于灭菌的离心管中，并用无菌水对其进行梯度稀释(10-1至10-8)。

2、将不同稀释梯度的环境样品接入含有苋菜红培养基的96孔板中，每个稀释度接12个培养孔。

对96孔板进行密封并放于厌氧工作站中培养，温度为30～37℃。

3、在培养后的96孔板上选取能使苋菜红还原脱色的高稀释度环境样品，接入20ml血清瓶中进行扩大培养。

血清瓶中的培养基与96孔板的培养基是相同的，都是苋菜红培养基。

4、将血清瓶中的样品进行稀释(10-1至10-4)后涂布于苋菜红固体培养基上，每个稀释度涂一个平板，然后将平板放于厌氧工作站中培养，温度为30～37℃。

5、在培养后的苋菜红固体培养基上寻找能使苋菜红脱色的单菌落，并用接种环进行挑取，采用平板划线法对其进行纯化。

经纯化得到纯菌株，并命名为RX1。

6、将菌株RX1接种于苋菜红培养基中，并将其放入厌氧工作站中培养，温度为30—37℃。

7、将培养后的菌株RX1菌液接入双室微生物燃料电池的阳极室，接入后通氮气15—25分钟，去除阳极室中的氧气。

密封好阳极室，通过钛丝和1000Ω电阻连通阴阳两极，形成完整外电路。

8、将组装好的双室微生物染料电池装置放于恒温培养箱中运行，温度为30—37℃，并通过连接电脑的数据采集器对装置产生的电流进行检测。

如图1所示，菌株RX1在双室微生物燃料电池中有明显的电压产生。

因此通过此方法，最终获得了产电菌RX1。

菌株RX1的电镜图如图2所示。

所述的苋菜红培养基的配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.8g/L、乙酸钠：1g/L、苋菜红：0.08g/L，溶剂为水，其配制方法是将十二水合磷酸氢二钠：17.1g、三水合磷酸氢二钾：3.93g、氯化钠：0.5g、氯化铵：1g、酵母提取物：0.8g、乙酸钠：1g、苋菜红：0.08g，溶于1L水中，混合均匀，灭菌即得。

所述的苋菜红固体培养基只是在苋菜红培养基中加入15g/L的琼脂，混合均匀，灭菌即得。

所述的双室微生物燃料电池，阴阳两极室的体积均为100ml，阴阳两极的电极材料均为
2cm×3cm的石墨板；阴阳两极通过0.5mm钛丝相连接，中间串联一个1000Ω的电阻；通过连接数据采集器和电脑来检测电流的产生。

所述的双室微生物燃料电池的阳极室中含有阳极室培养基，其配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.8g/L、乙酸钠：1g/L，溶剂为水，其配制方法是将十二水合磷酸氢二钠：17.1g、三水合磷酸氢二钾：3.93g、氯化钠：0.5g、氯化铵：1g、酵母提取物：0.8g、乙酸钠：1g溶于1L水中，混合均匀，灭菌即得。

所述的双室微生物燃料电池的阴极室中含有阴极室培养基，其配方为：铁氰化钾：
16.46g/L，溶剂为水，其配制方法为：将16.46g铁氰化钾溶于1L水中，灭菌即得。

实施例2
1、将环境样品进行过筛(100目)处理，去除样品中较大的杂质颗粒。

然后取适量环境样品于灭菌的离心管中，并对其用无菌水进行梯度稀释(10-1至10-8)。

2、将不同稀释梯度的环境样品接入含有甲基橙培养基的96孔板中，每个稀释度接12个培养孔。

对96孔板进行密封并放于厌氧工作站中培养，温度为30—37℃。

3、在培养后的96孔板上选取能使甲基橙还原脱色的高稀释度环境样品，接入20ml血清瓶中进行扩大培养。

血清瓶中的培养基与96孔板的培养基是相同的，都是甲基橙培养基。

4、将血清瓶中的样品进行稀释(10-1至10-4)后涂布于甲基橙固体培养基上，每个稀释度涂一个平板，然后将平板放于厌氧工作站中培养，温度为30—37℃。

5、在培养后的甲基橙固体培养基上寻找能使甲基橙脱色的单菌落，并用接种环进行挑取，采用平板划线法对其进行纯化。

6、将纯化的菌株接种于甲基橙培养基中，并将其放入厌氧工作站中培养，温度为30—37℃。

7、将培养后的菌液接入双室微生物燃料电池的阳极室，接入后通氮气15—25分钟，去除阳极室中的氧气。

密封好阳极室，通过钛丝和1000Ω电阻连通阴阳两极，形成完整外电路。

8、将组装好的双室微生物染料电池装置放于恒温培养箱中运行，温度为30—37℃，并通过连接电脑的数据采集器对装置产生的电流进行检测。

由此可筛选得到产电微生物。

所述的甲基橙培养基的配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.8g/L、乙酸钠：1g/L、甲基橙：0.12g/L，溶剂为水，其配制方法是将十二水合磷酸氢二钠：17.1g、三水合磷酸氢二钾：3.93g、氯化钠：0.5g、氯化铵：1g、酵母提取物：0.8g、乙酸钠：1g、甲基橙：0.12g/L，溶于1L水中，混合均匀，灭菌即得。

所述的甲基橙固体培养基只是在甲基橙培养基中加入15g/L的琼脂，混合均匀，灭菌即得。

所述的双室微生物燃料电池，阴阳两极室的体积均为100ml，阴阳两极的电极材料均为
2cm×3cm的石墨板；阴阳两极通过0.5mm钛丝相连接，中间串联一个1000Ω的电阻；通过连接数据采集器和电脑来检测电流的产生。

物：0.8g/L、乙酸钠：1g/L，溶剂为水，其配制方法是将十二水合磷酸氢二钠：17.1g、三水合磷酸氢二钾：3.93g、氯化钠：0.5g、氯化铵：1g、酵母提取物：0.8g、乙酸钠：1g溶于1L水中，混合均匀，灭菌即得。

所述的双室微生物燃料电池的阴极室中含有阴极室培养基，其配方为：铁氰化钾：16.46g/L，溶剂为水，其配制方法为：将16.46g铁氰化钾溶于1L水中，灭菌即得。

实施例3：
本实施例与实施例1基本相同，只是所述的苋菜红培养基的配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.5g/L、乙酸钠：0.83g/L、苋菜红：0.06g/L，溶剂为水。

所述的双室微生物燃料电池的阳极室中含有阳极室培养基，其配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.5g/L、乙酸钠：0.83g/L，溶剂为水。

实施例4：
本实施例与实施例1基本相同，只是所述的苋菜红培养基的配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：1g/L、乙酸钠：1.66g/L、苋菜红：0.1g/L，溶剂为水。

所述的双室微生物燃料电池的阳极室中含有阳极室培养基，其配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：1g/L、乙酸钠：1.66g/L，溶剂为水。

实施例5：
本实施例与实施例2基本相同，只是所述的甲基橙培养基的配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：1g/L、乙酸钠：1.66g/L、甲基橙：0.15g/L，溶剂为水。

物：1g/L、乙酸钠：1.66g/L，溶剂为水。

实施例6：
本实施例与实施例2基本相同，只是所述的甲基橙培养基的配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.5g/L、乙酸钠：0.83g/L、甲基橙：0.1g/L，溶剂为水。

所述的双室微生物燃料电池的阳极室中含有阳极室培养基，其配方为：十二水合磷酸氢二钠：17.1g/L、三水合磷酸氢二钾：3.93g/L、氯化钠：0.5g/L、氯化铵：1g/L、酵母提取物：0.5g/L、乙酸钠：0.83g/L，溶剂为水。