茚三酮比色法测定游离氨基氮

茚三酮比色法测定游离氨基氮
游离氨基酸的测定——茚三酮比色法标准曲线绘制
1. 实验原理
游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量。

因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。

2. 仪器与用具
100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；刻度吸管：0.1ml×1、1ml×2、2ml×2、5ml×l；沸水浴；具塞刻度试管20 ml×10；分光光度计
3. 试剂
3.1.1 水合茚三酮称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH
4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。

3.1.2 氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml （含氮为50ug/ ml），取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。

3.1.3 0.1%抗坏血酸称取0.1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配
4. 实验方法
取6支20ml试管，按下表加剂：
管号
试剂
1 2 3 4 5 6
亮氨酸标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
无氨蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
水合茚三酮(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
抗坏血酸(ml) 0.10.10.10.10.10.1氨基氮量（ug/管）0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min，取出后立即用冷水摇
动冷却，用60%乙醇定容至20 ml，摇匀。

0 0.025 0.055 0.099 0.146 0.186
λ=570nm处测定吸
光度
5. 标准曲线绘制
以吸光度为纵坐标，氨基氨ug 数为横坐标，绘标准曲线如图1。

图
1
茚三酮比色法测定游离氨基氮标准曲线
-0.05
00.05
0.10.15
0.2氨基氮（ug）
吸光度A
6. 待测样测定
取20ml 试管，取待测液1ml ，加蒸馏水l ml ，水合茚三酮3.0 ml ，坏血酸0.1ml ，混匀，封口。

沸水浴加热1 5分钟，冷水中摇动冷却，用 60%乙醇定溶至20ml ，摇匀，于570mn 测定吸光度A 。

7.计算结果：
测得吸光度，由标准曲线得知样液的氨基氮ug/ ml m ，代入公式
十算：
A=0.0382m-0.0103
A 为吸光度，代入公式算得m （ug/ ml ）。