CRISPR-Cas9系统在细菌学领域内的应用研究进展

CRISPR-Cas9系统在细菌学领域内的应用研究进展
肖婧;张宗德
【摘要】CRISPR-Cas免疫系统在天然状态下保护细菌和古生菌免受外来质粒或噬菌体的入侵.CRISPR-Cas9技术属于Ⅱ型CRISPR-Cas系统,它利用与靶序列互补的向导RNA引导Cas9酶定点切割DNA,该技术具有设计简单、操作方便、特异性强、效率高等优势,成为新一代基因组编辑技术.本文综述了CRISPR-Cas系统的最新分类和作用原理,重点介绍了近几年来CRISPR-Cas9系统应用于细菌学领域所取得的研究进展.%CRISPR-Cas systems naturally protect bacteria and archaea from foreign genetic elements such as plasmids or bacteriophages.In CRISPR-Cas9 technology from type Ⅱ[CRISPR-Cas systems,the DNA-cleaving activity is performed by a single enzyme Cas9 guided by a single-guide RNA.This system has become a powerful tool for genetic engineering because of its simple design,easy operation,high specificity and highe fficiency.In this review,we described the classification and mechanism of the CRISPR-Cas systems,the development and applications of CRISPR-Cas9 system in bacteria recently.
【期刊名称】《国际呼吸杂志》
【年(卷),期】2017(037)006
【总页数】7页(P450-456)
【关键词】CRISPR-Cas9系统;细菌;基因编辑;基因调节
【作者】肖婧;张宗德
【作者单位】101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所首都医科大学附属北京胸科医院分子生物学实验室耐药结核病研究北京市重点实验室;101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所首都医科大学附属北京胸科医院分子生物学实验室耐药结核病研究北京市重点实验室
【正文语种】中文
Fund program:National Science and Technology Major Project of China (2015ZX10004801-003);Collaborative Innovation Center of Infectious Diseases (PXM2015_014226_000058,PXM2016_014226_000052);Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201304)
1987年，Ishino等[1]在大肠杆菌中首次发现了一段独特的被非重复序列所间隔的“串联重复序列”。

2002年，Jansen等[2]将此特点的序列命名为成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPRs)。

2012年，Jinek等[3]首次体外证实CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)能够切割DNA，使得CRISPR-Cas9基因编辑技术取得了突破性进展。

目前该技术的研究集中于真核细胞领域，由于它也是我们理解细菌和对细菌进行基因编辑的重要工具。

因此，本文除了简单介绍了CRISPR-Cas 系统的最新分类和作用原理，还重点介绍了CRISPR-Cas9系统在细菌学领域内的应用进展。

CRISPR-Cas系统分布非常广泛且具有多样性，约50%的细菌和87%的古生菌中均存在CRISPR位点[4]。

2011年，Makarova等[5]根据cas基因家族将CRISPR-Cas系统分成Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中Ⅰ和Ⅲ型为多数细菌中存在的型别，而结构比较简单的Ⅱ型CRISPR-Cas9系统则被开发为全新的基因编辑工具。

2015
年，Makarova等[4]又根据干扰靶基因的效应蛋白的数量，将CRISPR-Cas系统
分为1类(包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型)和2类(包括Ⅱ和Ⅴ型)，共5种型16个亚型，这些
型或亚型之间参与的Cas蛋白的数目、CRISPR RNA(crRNA)加工处理的机制以及靶向的基因不一样(表1)[4-8]。

如表1所示，Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ型系统依赖前间隔序列毗邻基序(protospacer-adjacent motif,PAM序列)区分自身基因组中的间隔序列和入侵核酸中相同的前间隔序列，而Ⅲ型系统不依赖于PAM序列。

Ⅲ型系统是可以同时靶向RNA和DNA的CRISPR系统[9-10]。

Ⅴ型系统目前仅在新凶手弗朗西丝菌(Francisellanovicida)U112中鉴别出来，该系统crRNA的成熟不需要反式激活crRNA(Trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA)的参与，另外Cpf1-crRNA复
合物切割靶DNA产生的切口为黏末端，这点与Ⅱ型系统的平末端不同[11]。

以目前应用最广泛的CRISPR-Cas9系统为例，该系统由5′端的tracrRNA基因、中间一系列的Cas蛋白编码基因和3′端的CRISPR阵列组成，后者由引导序列、
间隔序列和重复序列顺序组成(图1)。

天然状态下，CRISPR-Cas9系统保护细菌和古生菌免受外来质粒或噬菌体的入侵，其免疫过程分为获取、表达和干扰三个阶段。

Jinek等[3]对Ⅱ型系统进行简化，将crRNA和tracrRNA融合成一条单链引导RNA(single-guide RNA，sgRNA)，因而体外切割DNA时不需要核糖核酸酶
Ⅲ(RNase Ⅲ)的处理，仅需sgRNA和Cas9蛋白即可(图2)。

sgRNA通过crRNA 与靶DNA的互补配对区结合，Cas9蛋白行使切割靶DNA的功能，靶DNA3′末
端的PAM序列(5′-NGG-3′)为Cas9的识别位点。

靶DNA发生双链断裂后，宿主通过同源重组(homologous recombination,HR)或非同源末端连接(Nonhomologous end joining,NHEJ)途径进行修复。

3.2 CRISPR-Cas9系统在细菌基因编辑中的应用
上述研究发表后，许多学者将此策略应用于其他细菌的基因编辑中，包括罗伊乳杆
菌(Lactobacillus reuteri)[18]、拜季林斯基梭菌(Clostridium beijerinckii)[19-20]、多种链霉菌(Streptomyces)[21-24]及大肠杆菌(Escherichia coli)其他方面的一些应用[25-28]。

2015年，Xu等[29]发现可以通过Cas9切口酶(nCas9)策略以减少DNA成为靶标之后细菌的致死性，从而改善解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)的基因编辑效果。

之后，Standage-Beier等[30]利用该策略在大肠杆菌中实现了基因大片段的删除。

上述研究利用的均是HR修复途径，其中修复模板可选用寡核苷酸单链或含DNA双链的质粒，二者均具有较高的编辑效率。

研究方法可根据实验需求，联合应用CRISPR阵列和tracrRNA(CRISPR阵
列:tracrRNA)或单独应用sgRNA。

利用CRISPR-Cas9系统在不同细菌中进行基因编辑的研究见表2。

Bikard等[34]除了在大肠杆菌中发现与Qi相似的结论外，还将dCas9应用于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，发现dCas9可以抑制肺炎链球菌中β-半乳糖苷酶的表达，降低倍数为14倍；该研究应用的CRISPR阵列:tracrRNA的研究方法，较sgRNA而言更适合进行多个不同crRNAs的比较研究。

Tong等[23]将dCas9用于放线菌中的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，发现dCas9可以抑制放线菌紫红素相关基因的表达。

近两年，除了大肠杆菌[33-38]，dCas9还被成功应用于多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)[39]、蓝藻细菌(Cyanobacteria)[40]和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)[41]等。

Choudhary等[42]将dCas9用于分枝杆菌中，结果发现不管是生长迅速的耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis，Msm)还是生长缓慢的结核分枝杆菌复合群菌(Mycobacterium tuberculosiscomplex bacteria，Mtb)，无论细菌中某种基因的天然表达水平如何，dCas9可以同时定向敲低分枝杆菌中多个目标基因的表达，且各基因的mRNA和蛋白水平可降低80%～90%；同时该方法还可快速鉴别
出对细菌生存具有重要作用的基因，之前被认为对所有分枝杆菌生长均重要的yidC基因，被发现在Mtb中为必需基因，在Msm中为非必需基因。

2016年7月，Singh等[43]利用dCas9重点对Mtb的6个重要基因
(inhA,dfrA,wag31,ftsZ,pknA,pknB)进行了功能性研究。

研究发现，CRISPRi技术可以成功抑制这些基因的表达，抑制效果大于80%，且未发现脱靶现象，另外细菌均呈现生长缓慢的生长表型方面的变化。

其中，inhA和dfrA基因的敲低引起了细菌对小分子化学抑制剂(异烟肼和甲氨蝶呤)敏感性的升高；wag3和ftsZ基因的敲低引起了细菌形态学表型方面的变化；靶向敲低pknA基因时处于同一操纵子的pknB基因的表达也受到抑制。

该研究再次证明了CRISPRi技术可持续有效地敲低Mtb的必需基因，并验证了该技术在一些表型分析研究中的应用价值。

与Cas9相比，dCas9可同时抑制多个基因却并不需要对基因进行修改，因此dCas9在基因功能研究方面和菌株培育方面更具优势。

利用dCas9在不同细菌中进行基因转录抑制方面调节的研究见表3。

CRISPR抗菌剂还可用于清除细菌中的抗生素耐药性质粒。

抗生素耐药性质粒为细菌自身携带的一种帮助细菌免于抗生素的杀灭作用的质粒。

2010年，Garneau等[46]第1次实验证实了CRISPR-Cas系统的这种质粒清除作用。

之后，Bikard等[44]和Citorik[45]等除了以细菌自身耐药基因为靶标成功制备了可以选择性靶向某种菌株的CRISPR抗菌剂，还以金黄色葡萄菌和大肠杆菌菌体内本身所含的抗生素耐药性质粒为靶标，实现了利用设计的噬菌粒成功地清除了细菌中的抗生素耐药性质粒。

2016年，Kim等[47]利用Ⅱ型 CRISPR-Cas9系统成功清除了产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase,ESBL)大肠杆菌内的抗生素耐药性质粒，实现了产ESBL大肠杆菌对抗生素的再敏感。

将来，如何改进噬菌粒的传递效率、开发新型的“运送载体”是进一步促进CRISPR抗菌剂取得重要进展的研究方向。

目前，多数研究关注的是CRISPR-Cas9技术在真核细胞领域内的应用，该领域内的研究进展在细菌领域内给予我们重要的启示。

例如，利用FokI-dCas9(fCas9)融合蛋白降低脱靶效应的研究[48-49]，也可用于改善细菌中的基因编辑效果；利用融合蛋白和调节因子的招募上调基因表达的研究[49-52]，也可用于提高细菌中的上调效果；真核细胞领域内分子成像方面的研究[52]，也可用于细菌学领域，以帮助我们了解细菌染色体的结构、动力学以及环境变化对染色体结构的影响等。

在细菌学领域中，除了外源性引入全套的Ⅱ型CRISPR-Cas9系统，还可以充分利用细菌中已经存在的、内源性的CRISPR-Cas系统，但必须确保该内源性系统是有活性的，且需考虑到其对宿主天然防御功能的干扰作用。

这种策略最大的优点是仅通过引入合成的CRISPR阵列而不需要额外添加系统中所需的其他必要组分即可实现该系统的应用，这对于需要多种蛋白参与的Ⅰ型系统来说尤为便利(表1)。

目前已经有学者应用此策略进行了CRISPR抗菌剂[17]、大片段删除[16]和基因抑制[53]等方面的研究。

虽然CRISPR-Cas9系统的应用已经取得了突飞猛进的发展，但是对于一个仅有三年多应用史的技术来说，它仍有许多发展和改造的空间。

2016年5月，我国韩春雨团队所发表的NgAgo-gDNA基因编辑系统，为基因编辑技术带来了新的思路[54]。

相信在不远的将来，CRISPR-Cas9系统及其衍生技术也会为细菌学领域的发展发挥其应有的作用。