联合PTEN、p14ARF、Survivin在肺癌中的检测及治疗意义

联合PTEN、p14ARF、Survivin在肺癌中的检测及治疗意义
目的联合检测PTEN、p14ARF、Survivin在肺癌中的表达及相互关系，为肺癌诊断、监测发展及基因治疗提供理论依据。

方法用免疫组织化学法检测2009年1月～2015年12月本院87例支气管肺癌组织和13例正常肺组织中PTEN、p14ARF、Survivin基因的表达及其相关性。

结果PTEN、p14ARF表达在正常肺组织高于肺癌，而Survivin则相反；PTEN、p14ARF表达随肺癌细胞恶性程度增加而减少，而Survivin则相反，且在高、中、低分化各组间表达差异有统计学意义（P＜0.01）；在临床分期组随临床分期的增大，PTEN、p14ARF表达减少，而Survivin表达增强，且三者在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期表达比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

PTEN、p14ARF有协同作用（r=0.6489，P＜0.01），Survivin与PTEN，与p14ARF互为反作用（r=-0.5743，P＜0.01；r=-0.6860，P ＜0.01）。

结论PTEN、p14ARF和Survivin共同调控肺癌细胞的凋亡和增殖，为三者在肺癌中的联合治疗提供理论依据。

标签：肺癌；基因治疗；PTEN；p14ARF；Survivin；细胞周期；调亡
肺癌的发生、发展和基因治疗与细胞凋亡和增殖密切相关。

细胞在进行增殖的同时，伴随细胞凋亡，调控他们之间的平衡是维持机体正常的生理功能和组织器官形态的基础。

PTEN是新近发现的第一个具有磷酸酯酶活性的肿瘤抑制基因，主要参与细胞增殖周期和凋亡中所发生的去磷酸化作用。

p14ARF是新近发现的周期素依赖性激酶抑制蛋白，是直接调控细胞周期并且促进凋亡的抑癌基因。

Survivin是凋亡抑制蛋白IAP家族成员之一，又名生存素，是新近凋亡抑制基因。

三种基因蛋白在细胞周期调控和凋亡中具有相同作用通路，并且在肿瘤靶向治疗中已经成为研究热点，目前尚未对它们进行联合研究。

所以本文用免疫组化方法检测PTEN、p14ARF、Survivin基因蛋白的表达及相关性，探讨其在肺癌发生、发展中的作用和临床意义。

1材料与方法
1.1材料
收集2009年1月～2015年12月在内蒙古医院及内蒙古第四医院病理科存档的肺癌蜡块87例和手术切除的正常肺组织13例，分别为支气管肺癌组和正常肺组织组。

1.2方法
采用免疫组化S-P法测定PTEN、p14ARF和Survivin基因蛋白的表达。

应用形态学显微图像分析系统对每张切片随机选取5个高倍视野，测其平均光密度值，取其平均值，采用平均光密度值代表各项指标的表达。

1.3统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析。

两独立样本根据方差齐性行T/T′检验；多个样本均数行F检验，差别有统计学意义行两两比较多重极差检验；Survivin、PTEN、p14ARF之间的关系采用Pearson线性相关分析。

2结果
2.1 PTEN、p14ARF、Survivin基因在正常肺脏组织和支气管肺癌组织中的表达
正常肺脏组织中PTEN、p14ARF表达高于肺癌组织，而Survivin则相反。

两组PTEN、p14ARF和Survivin比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2 PTEN、p14ARF、Survivin基因在肺癌临床病理中的表达
组织学分型中PTEN、p14ARF、Survivin表达差异无统计学意义（P>0.05）；在分化程度组随分化程度的降低，PTEN、p14ARF表达减少，Survivin表达增强，且在高、中、低分化各组间表达差异有统计学意义（P＜0.01）；在临床分期组随临床分期的增大，PTEN、p14ARF表达减少，而Survivin表达增强，三者且在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期间表达比较，差异有统计学意义（P＜0.01）（表2）。

2.3 PTEN、p14ARF、Survivin基因在肺癌组织中的相关分析
作Pearson线性相关分析得出，PTEN与p14ARF的表达相关系数为r=0.6489，Survivin与PTEN的表达相关系数为r=-0.5743，Survivin与p14ARF相关系数为r=-0.6860，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1～图3）。

3讨论
肺癌的发生、进展与细胞增殖和凋亡这两个紧密相连的细胞活动平衡相关联，干预细胞的增殖和凋亡目前已经成为基因治疗的基础[1-2]。

PTEN具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的新型抑癌基因。

PTEN蛋白的脂质磷酸酶活性通过磷酸化PIP3，负性调节PI3K/AKT/PKB信号通路。

该信号通路在肿瘤发生发展、侵袭转移及细胞耐药中起重要作用。

阻断凋亡相关蛋白天冬氨酸半胱氨酸酶capase家族的活化；阻断下游癌蛋白MDM2分子，使p53失活[3-4]，为当前肿瘤靶向治疗研究热点。

傅玉峰等[5]通过质粒转染的方式，增加PTEN 在肿瘤细胞中的表达，结果发现PTEN表达的增强抑制了耐药细胞在顺铂培养基中的生长，促进其凋亡。

增加了耐药肿瘤细胞药物敏感性作用。

刘琳等[6]在垂体腺瘤侵袭性研究中证实PTEN蛋白基因失活可能促进了肿瘤血管形成，有助于垂体腺瘤侵袭性。

p14ARF是位于INK4a-ARF基因位点CDKN2A的可变读框[7]。

p14ARF与MDM2、p53形成复合物。

结合MDM2减少p53被屏蔽于细胞核内被泛素化酶降解作用，使p53蛋白的半衰期延长，稳定p53水平加速MDM2降解发挥其抑癌效应，引起细胞周期阻滞于G1/G2期[8]。

p14ARF与细胞周期素D（CyclinD）竞争结合并抑制CDK4/CDK6活性，使细胞分裂被阻滞于G1期[9]。

由于p14ARF 基因的cDNA长度短，便于基因克隆的操作，并具有显著的细胞周期负调控作用，是抑制肿瘤生长和提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性的理想基因[10]。

胡义德等[11]用p14ARF表达载体基因转染肺腺癌细胞系，可使肺腺癌细胞Tpot延长同时伴随G0/G1期和G2/M期细胞显著增加。

张群华等用脂质介导方法将p14ARF 基因转导至人胰腺癌细胞株，胰腺癌细胞得到很好控制。

宋海峰等[12]扩增了Ad-p14ARF复制腺病毒导入在裸鼠皮下构建肝癌细胞株中的癌细胞凋亡，凋亡细胞比例与腺病毒滴度呈现一定的剂量相关性。

生存素Survivin其N末端含有凋亡抑制蛋白IAP重复序列（BIR）结构域，BIR分子中含有对凋亡有重要作用的氨基酸残基，Survivin通过这些残基与Caspase家族结合，抑制Caspases的活性，从而在上游阻断凋亡信号的传导，导致细胞在G2/M期凋亡，且与其他IAP 比较具有更强的选择性[13]。

此外，Survivin蛋白的C末端由42个氨基酸组成的两性α螺旋结构与细胞分裂微管蛋白结合，与抗凋亡活性紧密相关[14]。

Survivin 还与周期素依赖性激酶4（CDK4）结合，使细胞分裂被阻滞于G1期[15]。

在血管生成过程中，多种促血管生成因子如血管内皮生长因子等都能通过上调Survivin表达促进血管内皮细胞增殖。

Survivin特异性调节细胞周期及控制凋亡，使其为解决肿瘤化学药物疗法特异性差、毒性强的缺点开辟了新的途径。

Shapiro[16]将Survivin-CDKs抑制剂已用于临床肿瘤治疗，目前已进入Ⅱ期临床试验。

Aggarwal等[17]Survivin反义寡核苷酸可下调Survivin mRNA表达，诱导凋亡，增加肺腺癌细胞对化疗药依托泊苷的敏感性。

综上所述，PTEN蛋白、Survivin蛋白、p14ARF蛋白在癌细胞周期及凋亡上存在共同作用途径。

本实验经相关分析发现，Survivn与PTEN、p14ARF负相关，而且近年来在肿瘤治疗方面PTEN、p14ARF转基因治疗和反义Survivin基因治疗备受关注，并显示出良好的靶向性、特异性及安全性，本文为联合三种基因治疗提供了理论基础。

PTEN、p14ARF、Survivin与肺癌临床病理关系紧密相连，认为这三种蛋白有望成为肺癌早期诊断的有效指标。

[参考文献]
[1]朱玉贤，李毅，郑晓峰，等.现代分子生物学[M].北京：高等教育出版社，2016：374-404.
[2]赵彦超，顾耘.细胞凋亡通路研究进展[J].现代医学，2013，3（30）：285-288.
[3]Maeda M，Murakami Y，Watari K，et al.CpG hypermethylation contributes to decreased expression of PTEN during acquired resistance to gefitinib in human lung cancer cell lines[J].Lung Cancer，2015，87（3）：265-271.
[4]Ho J，Bassi C，Stambolic V.Characterization of nuclear PTEN and its post
translational modifications[J].Methods，2015，（77-78）：104-111.
[5]傅玉峰，陈培，李雪埔，等.抑癌基因PTEN提高耐药食管癌化疗敏感性的作用及其机制研究[J].中国临床研究，2016，29（2）：214-217.
[6]刘琳，刘丽静，张忠梅.PTEN蛋白及微血管密度表达对垂体瘤侵袭性影响的研究[J].人民军医，2016，59（1）：53-55.
[7]陈军，吴飞翔，覃思繁，等.肝细胞癌组织STAT3和P14ARF蛋白的表达及相关研究[J].实用肿瘤杂志，2013，28（1）：24-26.
[8]Sharma G，Mirza S，Prasad CP，et al.Promoter hypermethylation of P16INK4A，P14ARF，Cyclin D2 and slit2 in serum and tumer DNA from breast cancer patients[J].Life sci，2007，80（20）：1873-1881.
[9]Suzuki H，Kurita M，Mizumoto K，et al.The ARF tumor suppressor gene inhibits BcL6-mediated transcriptional repression[J].Biol Chem Biophys Res Commum，2015，32（1）：242-245.
[10]陈瑞莲，郑秀，李励军，等.Fhit、P14ARF、及Caspase-3在子宫内膜腺癌中的表达及意义[J].莆田学院学报，2015，22（2）：22-25.
[11]胡义德，高楠，曹晓运，等.p14ARF对照射后肺癌细胞加速再群体化抑制效应[J].中华放射肿瘤学杂志，2013，9（3）：187-189.
[12]宋海峰，钱海利，张雪艳，等.复制缺陷型腺病毒Ad一p14ARF治疗肝细胞癌的实验研究及作用机制的探讨[J].中华肿瘤杂志，2016，28（9）：641-645.
[13]王迎雪.Bcl-2，survivin基因多态性与甲状腺乳头状癌的发病风险及其蛋白表达差异的相关性研究[D].济南：山东大学，2013.
[14]胡迪，胡孝渠，李权.Survivin、Caspase-8在人体乳腺增生、乳腺癌癌前病变和乳腺癌中的表达程度分析[J].临床与药物，2015，27（5）：56-58.
[15]孟雪梅，赵小卫.Ck2α、β-catenin、C-IAP1及survivin联合检测在宫颈癌诊断中的临床意义[J].解放军医药杂志，2015，27（5）：56-58.
[16]Shapiro GI.Preclinical and clinical development of the cyclin-dependent kinase in hibit or flavopiridol[J].Clin Cancer Res，2014，10（12）：4270-4275.
[17]Aggarwal A，Baker CS，Evans TW，et al.G-CSF and IL-8 but not GM-CSF correlate with severity of pulmonary neutrophilia in acute respiratory distress syndrome[J].Eur Respir J，2012，15（5）：895-901.。