细胞克隆形成实验，你做对了吗？

细胞克隆形成实验，你做对了吗？
“克隆”顾名思义，即体细胞无性繁殖，1个细胞分裂成2个细胞，进行种群繁殖并扩大的过程，通过克隆形成率可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状，是体外测定细胞增殖能力的一种常用技术。

这项实验虽然操作简单，却有很多同学在最终拍照时很难拿到好看的图片，不得不一次又一次重复实验，今天我们就看看如何规范的做克隆形成实验。

克隆形成的目的
1. 评价不同杀伤因素（药物、基因等）对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性；
2. 评价细胞在体内成瘤性，癌细胞不一定都可以在体内成瘤，但若体外克隆能力越强，即表明体内成瘤性越强，算是一种模拟体内成瘤的体外实验。

克隆形成实验步骤
a.接种：取对数期生长的细胞以500-1000个/孔的密度接种于6孔板（接种时注意梯度稀释细胞悬液，观察细胞密度，以免因计数不准确导致实验结果偏差），每个实验组设3个复孔，培养基为含30%FBS的完全培养基；
b.于细胞培养箱中培养7-14天左右，每隔3天进行换液并观察细胞状态，显微镜下观察克隆大小（3复孔之间克隆大小应相似），待单个克隆生长到大小不超过图片视野时可以进行拍照（如下图左）
c.固定染色：移除培养基，PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛固定细胞
20 min；移除多聚甲醛，用0.2%结晶紫染色5min；用水洗涤细胞，晾干，扫描拍照；（如下图右）
d.计数
注意！注意！注意！高能预警
细胞密度为多少合适？
细胞接种密度与最终实验结果密切相关，若细胞太多，形成克隆数目太多，很难拍到单独的克隆团。

而细胞太少，可能无法形成克隆，
从而影响对该细胞增殖能力的判断。

一般来说，正常增殖速度为1:5-1:10传代，3天长满细胞，可以接种500个细胞，其余增殖缓慢细胞，可以接种800-1000。

细胞接种后培养的时间，如何确定？
通常情况下，单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆，时间约为一周；但具体时间因细胞增殖能力而已异，因此应密切关注细胞生长情况，隔天在显微镜下观察克隆情况，若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。

细胞铺板均匀的重要性
若铺板不均匀，细胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影响统计结果，并且拍出的图片不美观。

细胞未形成克隆的原因？
并非每种细胞都可以形成克隆，克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。

还与接种细胞密度，加入培养液的体积、血清浓度有关。

因该实验处理时间较长，应给细胞多加培养基，如每孔4ml，或者3天更换一次培养基，以供给细胞充足的营养。

以上为本次为大家介绍的细胞克隆形成的实验方法，它们的操作过程很简单，但是我们会遇到很多小问题，导致最终结果不理想，切记，控制接种密度，铺板均匀是2大关键点，多多练习摸索，一定会有好数据和图片哦！。