激光共聚焦显微镜的样本
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当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可
以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。
4、分层扫描（切片扫描）
较厚层面
较薄层面
人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。
4、分层扫描（切片扫描）
连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴
的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间 结构，空间定位，三维重组。
院内5折，校内8 折
只允许3天后15天内的预约 zhenli@ 多线氩离子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm) 半导体激光器：405 nm, 559 nm, 635 nm 上转换专用激光器：808 nm,980 nm 活细胞CO2培养系统
普通激光共聚焦显微镜的功能 上转换材料的成像检测
基本原理
样品 入射光 发射光
滤光片 激光器 扩光器 长通滤光片
针孔
检测器
基本原理
样品 入射光 发射光
滤光片 激光器 扩光器 长通滤光片
针孔
检测器
基本原理
样品 入射光 发射光
滤光片 激光器 扩光器 长通滤光片
针孔
检测器
仪器特点
1、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。 因为激光的单色性强、光源波束集中、波 长相同。 2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔， 将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。
1、开机和关机需要管理员来操作 2、换样本的时候需要将物镜降下来， 或点击软件上Escape 3、能用普通荧光显微镜观察拍照的样 本就不要用共聚焦显微镜，节约激光器 寿命。
上转换共聚焦扫描显微镜
OLYMPUS FV1200 放置地点：401-1111 管理员：吴艳 普通共聚焦：400元/小时 上转换共聚焦：1000元/小时
荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑 分析可对荧光信号进行相对定量测定。
随机圈取细胞 可得到所圈细胞的相对荧光强度值
3、荧光标记表达量测定
利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组 间荧光标记蛋白表达的差异。
4、分层扫描（切片扫描）
按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样
品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到， 而其他层面不影响成像。
仪器特点
3、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空 间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源） 逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最 后得到一个整体平面的或立体的像。
4、图像信号及处理： 光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信 号。
激光共聚焦显微镜的优势
更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光 信号放大。只要有信号就能被检测到。 定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、 和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。 光漂白和荧光淬灭作用小： 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算 机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。
细胞骨架探针
F-肌动蛋白荧光探针：
鬼笔环肽：特异性地与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳 摩尔浓度下也可标记
仪器参数
IX83
针孔光栏 分光镜 发射荧光单色器及检测器 计算机图像存储与处理及控制系统
多线氩离子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm) 半导体激光器：405 nm, 559 nm, 635 nm 上转换专用激光器：808 nm,980 nm
仪器参数
仪器参数
仪器参数
基本原理
吴艳 分子影像与核医学研究中心 401#1124
荧光显微镜
Fluorescence microscopy
荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光 学显微镜，目前主要由光源、滤片系统、光路系统 等组成。
广泛应用在生命科学领域，可对组织和细胞的 结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进行定位、 定性观察及分析。
线（狭缝）扫描共聚焦显微镜
分辨率低，速度快，噪音高
转盘式扫描共聚焦显微镜
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ性能介于上述两者之间
激光共聚焦扫描显微镜
OLYMPUS FV1200 研究级倒置荧光显微镜 参加过仪器使用培训，通过网上仪 器知识考试，网上提前预约，管理 员审核通过方可使用。
注意事项：
放置地点：401-1312室 管理员：吴安庆老师 收费：200元/小时
激光共聚焦显微镜的样本
石蜡切片，冰冻切片，涂片，印片、 铺片，培养的粘附细胞，悬浮细胞，各 种染色，非染色荧光标记的组织（包括 活组织）
共聚焦显微镜的应用
高清晰成像 2) 半定量荧光强度分析 3) 荧光探针表达量测定 4) 分层扫描 5) 多种荧光标记同时检测
1)
1、高清晰成像
激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平
仪器型号： OLYMPUS IX73 研究级倒置荧光显微镜
显微镜参数
1．主机功能：系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能； 2．透射光光源：外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置； 3．物镜：长工作距离万能平场半复消色差相差（荧光）物镜：4×（
数值孔径N.A.≥0.13）、10×（N.A.≥0.3），20×（N.A.≥0.7）、40×（ N.A.≥0.6），60X×（N.A.≥0.7） 4．物镜转盘：6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜信 息，随物镜转换能够自动校准标尺； 5．载物台：精确定位功能手动载物台；具备XY锁定和复位功能, 可重 现标本位置，游标尺的精度≤100μm； 6．聚光镜：超长工作距离万能聚光镜，孔位数≥5；
基本原理
高 压 汞 灯
滤镜 分光
被荧光 紫外 激发 探针染 蓝 色的生 绿 物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
（一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片） 带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及 使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达 普通光学显微镜的1.4倍。
可以清晰的表现某些细微结构。
高清晰成像
鼠成纤维细胞 单克隆anti–β -tubulin标记
高清晰成像
涡虫纲扁虫肌动蛋白丝 鬼笔环肽
高清晰成像
培养的人肝癌细胞吖叮橙染色
2、半定量荧光强度分析
常用荧光探针介绍
1. 细胞活性探针
2. 细胞器探针
3. 细胞骨架探针
4. 核酸探针
5. 细胞内离子探针
细胞活性探针
活细胞探针：吖叮橙（AO）
是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶 体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中 浓集。
死细胞探针：碘化丙锭（PI）
膜不透性DNA探针，细胞膜破损后与DNA结合
显微镜参数
7．荧光照明器：主机反射荧光系统可采用复眼照明技术，平均荧光视
野亮度，便于量化分析； 8. 荧光光源：130W以上长寿命荧光光源, 光导管传输，长度1.5米，符 合RoHS 和WEEE法令要求； 9. 高通透性荧光激发块：紫外， BP340-390, DM410，BA420-IF 蓝色，BP460-495, DM505，BA510-IF 绿色，BP530-550, DM570，BA575-IF； 10．荧光激发块转盘：编码型荧光激发块转盘，≥7孔位设计，便于今 后扩展应用,无需工具即可更换滤色镜组,与软件连接后能够随图片保存 荧光滤色镜组信息； 11．滤色镜：透射用日光平衡滤色片、绿色滤色片，荧光用减光片 ND6/ND25； 12．DIC附件：40X、60X物镜配置微分干涉附件。
荧光显微镜
Fluorescence microscopy
参加过仪器使用培训，通过 网上仪器知识考试，网上提 前预约，管理员审核通过方 可使用。
注意事项： 汞灯使用时尽量减少启动次 数；灯熄灭后要等待冷却才 能重新启动；点燃灯泡后不 可立即关闭，以免水银蒸发 不完全而损坏电极，一般需 要等15min 放置地点 ：401-1312室 管理员：吴安庆老师
激光共聚焦扫描显微镜
（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ）
以激光作为光源，采用光源针孔与检测针 孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以 获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统
共聚焦显微镜的类型
点（慢）扫描共聚焦显微镜
分辨率高，图像清晰，采集图像速度慢
• •
注意事项:
1、为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银蒸发不完 全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。
2、汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气尚未恢复 到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路，导致汞灯爆炸。这 样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢出，将导致工作室污染。故关 闭汞灯之后，不能马上再次打开，必须等待至少30分钟。
开了不能马上关，关了不能马上开。
荧光显微镜的不足:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的 同时采集及共定位。 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.只能在二维环境下观察。
6.样品不能太厚。
5、多色荧光标记检测
普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光 标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显 微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。
绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子
肺动脉内皮细胞 蓝色：Hoechst 33342 ，染DNA 红色：PI，染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白
• • • • •
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。 （三）标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜 直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较 亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等 量混合液作封裱剂。 （五）镜油 一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的 无荧光镜油，也可用上述甘油代替。
核酸探针
•
Hoechst 与DNA结合，分辨率高
Hoechst 33258 Hoechst 33342 毒性低 先进行免疫染色再进行Hoechst染色
•
DAPI 与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链 DNA结合无荧光增强。荧光强度比Hoechst低， 光稳定性强于Hoechst。
细胞器探针
线粒体探针：罗丹明123（Rhodamine123），能 渗入细胞，带阳离子的荧光探针，不染色内质网。 溶酶体探针：中性红（Neutral Red） 内质网探针：DiOC6属于短链碳酸花青苷染料。 可标记活细胞内质网，也可用于甲醛固定的细胞 内质网。
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
阻断滤镜：吸收和阻挡激发光进入目镜；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。
多为长通滤色镜；LP490
标本制作要求
（一）载玻片
•
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面 不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时 需用石英玻璃载玻片。 （二）盖玻片
以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。
4、分层扫描（切片扫描）
较厚层面
较薄层面
人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。
4、分层扫描（切片扫描）
连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴
的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间 结构，空间定位，三维重组。
院内5折，校内8 折
只允许3天后15天内的预约 zhenli@ 多线氩离子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm) 半导体激光器：405 nm, 559 nm, 635 nm 上转换专用激光器：808 nm,980 nm 活细胞CO2培养系统
普通激光共聚焦显微镜的功能 上转换材料的成像检测
基本原理
样品 入射光 发射光
滤光片 激光器 扩光器 长通滤光片
针孔
检测器
基本原理
样品 入射光 发射光
滤光片 激光器 扩光器 长通滤光片
针孔
检测器
基本原理
样品 入射光 发射光
滤光片 激光器 扩光器 长通滤光片
针孔
检测器
仪器特点
1、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。 因为激光的单色性强、光源波束集中、波 长相同。 2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔， 将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。
1、开机和关机需要管理员来操作 2、换样本的时候需要将物镜降下来， 或点击软件上Escape 3、能用普通荧光显微镜观察拍照的样 本就不要用共聚焦显微镜，节约激光器 寿命。
上转换共聚焦扫描显微镜
OLYMPUS FV1200 放置地点：401-1111 管理员：吴艳 普通共聚焦：400元/小时 上转换共聚焦：1000元/小时
荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑 分析可对荧光信号进行相对定量测定。
随机圈取细胞 可得到所圈细胞的相对荧光强度值
3、荧光标记表达量测定
利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组 间荧光标记蛋白表达的差异。
4、分层扫描（切片扫描）
按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样
品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到， 而其他层面不影响成像。
仪器特点
3、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空 间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源） 逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最 后得到一个整体平面的或立体的像。
4、图像信号及处理： 光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信 号。
激光共聚焦显微镜的优势
更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光 信号放大。只要有信号就能被检测到。 定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、 和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。 光漂白和荧光淬灭作用小： 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算 机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。
细胞骨架探针
F-肌动蛋白荧光探针：
鬼笔环肽：特异性地与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳 摩尔浓度下也可标记
仪器参数
IX83
针孔光栏 分光镜 发射荧光单色器及检测器 计算机图像存储与处理及控制系统
多线氩离子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm) 半导体激光器：405 nm, 559 nm, 635 nm 上转换专用激光器：808 nm,980 nm
仪器参数
仪器参数
仪器参数
基本原理
吴艳 分子影像与核医学研究中心 401#1124
荧光显微镜
Fluorescence microscopy
荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光 学显微镜，目前主要由光源、滤片系统、光路系统 等组成。
广泛应用在生命科学领域，可对组织和细胞的 结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进行定位、 定性观察及分析。
线（狭缝）扫描共聚焦显微镜
分辨率低，速度快，噪音高
转盘式扫描共聚焦显微镜
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ性能介于上述两者之间
激光共聚焦扫描显微镜
OLYMPUS FV1200 研究级倒置荧光显微镜 参加过仪器使用培训，通过网上仪 器知识考试，网上提前预约，管理 员审核通过方可使用。
注意事项：
放置地点：401-1312室 管理员：吴安庆老师 收费：200元/小时
激光共聚焦显微镜的样本
石蜡切片，冰冻切片，涂片，印片、 铺片，培养的粘附细胞，悬浮细胞，各 种染色，非染色荧光标记的组织（包括 活组织）
共聚焦显微镜的应用
高清晰成像 2) 半定量荧光强度分析 3) 荧光探针表达量测定 4) 分层扫描 5) 多种荧光标记同时检测
1)
1、高清晰成像
激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平
仪器型号： OLYMPUS IX73 研究级倒置荧光显微镜
显微镜参数
1．主机功能：系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能； 2．透射光光源：外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置； 3．物镜：长工作距离万能平场半复消色差相差（荧光）物镜：4×（
数值孔径N.A.≥0.13）、10×（N.A.≥0.3），20×（N.A.≥0.7）、40×（ N.A.≥0.6），60X×（N.A.≥0.7） 4．物镜转盘：6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜信 息，随物镜转换能够自动校准标尺； 5．载物台：精确定位功能手动载物台；具备XY锁定和复位功能, 可重 现标本位置，游标尺的精度≤100μm； 6．聚光镜：超长工作距离万能聚光镜，孔位数≥5；
基本原理
高 压 汞 灯
滤镜 分光
被荧光 紫外 激发 探针染 蓝 色的生 绿 物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
（一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片） 带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及 使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达 普通光学显微镜的1.4倍。
可以清晰的表现某些细微结构。
高清晰成像
鼠成纤维细胞 单克隆anti–β -tubulin标记
高清晰成像
涡虫纲扁虫肌动蛋白丝 鬼笔环肽
高清晰成像
培养的人肝癌细胞吖叮橙染色
2、半定量荧光强度分析
常用荧光探针介绍
1. 细胞活性探针
2. 细胞器探针
3. 细胞骨架探针
4. 核酸探针
5. 细胞内离子探针
细胞活性探针
活细胞探针：吖叮橙（AO）
是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶 体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中 浓集。
死细胞探针：碘化丙锭（PI）
膜不透性DNA探针，细胞膜破损后与DNA结合
显微镜参数
7．荧光照明器：主机反射荧光系统可采用复眼照明技术，平均荧光视
野亮度，便于量化分析； 8. 荧光光源：130W以上长寿命荧光光源, 光导管传输，长度1.5米，符 合RoHS 和WEEE法令要求； 9. 高通透性荧光激发块：紫外， BP340-390, DM410，BA420-IF 蓝色，BP460-495, DM505，BA510-IF 绿色，BP530-550, DM570，BA575-IF； 10．荧光激发块转盘：编码型荧光激发块转盘，≥7孔位设计，便于今 后扩展应用,无需工具即可更换滤色镜组,与软件连接后能够随图片保存 荧光滤色镜组信息； 11．滤色镜：透射用日光平衡滤色片、绿色滤色片，荧光用减光片 ND6/ND25； 12．DIC附件：40X、60X物镜配置微分干涉附件。
荧光显微镜
Fluorescence microscopy
参加过仪器使用培训，通过 网上仪器知识考试，网上提 前预约，管理员审核通过方 可使用。
注意事项： 汞灯使用时尽量减少启动次 数；灯熄灭后要等待冷却才 能重新启动；点燃灯泡后不 可立即关闭，以免水银蒸发 不完全而损坏电极，一般需 要等15min 放置地点 ：401-1312室 管理员：吴安庆老师
激光共聚焦扫描显微镜
（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ）
以激光作为光源，采用光源针孔与检测针 孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以 获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统
共聚焦显微镜的类型
点（慢）扫描共聚焦显微镜
分辨率高，图像清晰，采集图像速度慢
• •
注意事项:
1、为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银蒸发不完 全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。
2、汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气尚未恢复 到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路，导致汞灯爆炸。这 样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢出，将导致工作室污染。故关 闭汞灯之后，不能马上再次打开，必须等待至少30分钟。
开了不能马上关，关了不能马上开。
荧光显微镜的不足:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的 同时采集及共定位。 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.只能在二维环境下观察。
6.样品不能太厚。
5、多色荧光标记检测
普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光 标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显 微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。
绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子
肺动脉内皮细胞 蓝色：Hoechst 33342 ，染DNA 红色：PI，染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白
• • • • •
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。 （三）标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜 直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较 亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等 量混合液作封裱剂。 （五）镜油 一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的 无荧光镜油，也可用上述甘油代替。
核酸探针
•
Hoechst 与DNA结合，分辨率高
Hoechst 33258 Hoechst 33342 毒性低 先进行免疫染色再进行Hoechst染色
•
DAPI 与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链 DNA结合无荧光增强。荧光强度比Hoechst低， 光稳定性强于Hoechst。
细胞器探针
线粒体探针：罗丹明123（Rhodamine123），能 渗入细胞，带阳离子的荧光探针，不染色内质网。 溶酶体探针：中性红（Neutral Red） 内质网探针：DiOC6属于短链碳酸花青苷染料。 可标记活细胞内质网，也可用于甲醛固定的细胞 内质网。
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
阻断滤镜：吸收和阻挡激发光进入目镜；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。
多为长通滤色镜；LP490
标本制作要求
（一）载玻片
•
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面 不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时 需用石英玻璃载玻片。 （二）盖玻片