乳酸脱氢酶的测定

➢ 单位定义：以100ml血清，37度，作用底物15min，产生1umol丙酮酸为 一个金氏单位。
➢ 参考范围：190-437金氏单位 ➢ 注意事项： ➢ 1．乳酸锂、乳酸钾、乳酸钠都可以作为LD的底物，但后两种为水溶
液，若保存不当容易产生酮酸类物质从而抑制酶促反应，且含量不够 准确，目前少用，而乳酸锂为固体，稳定，易称重。 ➢ 2．除用二乙醇胺缓液外，还可用TRIS或焦磷酸缓冲液。而甘氨酸对 LD有抑制作用，故不采用甘氨酸缓冲液。 ➢ 3．标本严禁溶血，也不采用草酸盐，EDTA抗凝血浆。由于LD4， LD5对冷不稳定，不应贮存于冰箱中，血清标本室温可存放2-3天。 ➢ 4．比色应在5-15分钟内完成，否则吸光度值会降低。 ➢ 评价： ➢ LD活性测定多采用乳酸生成丙酮酸的反应方向，但反应开始的转化 速率是不成线性的，反应速率与温度有关，温度越高，速度越快。以 丙酮酸作为底物测定的酶活性所得结果不精确。
22酶活性的测定酶活性的测定加入物加入物mlml测定管测定管对照管对照管血清血清001001001001nadnad底物缓冲液底物缓冲液050505053737度水浴度水浴5min5minnadnad溶液溶液01013737度水浴度水浴15min15min2424二硝基苯肼二硝基苯肼05050505nadnad溶液溶液01013737度水浴度水浴1515分钟分钟04moll04moll溶液溶液50505050混匀室温放置混匀室温放置5min5min后于后于440nm440nm波长处比色比色杯光径为波长处比色比色杯光径为10cm10cm用蒸馏水调零读取各管吸光度
乳酸脱氢酶的测定
➢ 概述：乳酸脱氢酶是一种氧化还原酶，其辅酶为NAD＋， 为糖酵解的关键酶，广泛分布于人体及动物的各种组织内。 人体以肾、心及骨骼最为丰富，其次是肝、脾、胰及肺组 织内较多。红细胞中LDH较血清高100倍，溶血标本不宜 测定LDH。
➢ 它以辅酶1为辅酶，催化乳酸和丙酮酸之间的可逆性氧化 还原反应。反应的平衡点明显地倾向乳酸的生成，即倾向 于丙酮酸的还原，此时的最适PH为7.4-7.8，只需较低浓度 的底物，（1.2mmol/L丙酮酸，0.15mmol/L的NADH）， 即至最适反应浓度，而进行乳酸氧化反应时，最适PH为 8.8-9.8，因碱性条件可不断移去反应生成的H＋，以利反 应NADH方向进行。并且此时底物浓度需加大至30倍以上， （50mmol/L乳酸，5mmol/LNAD＋）才至最适浓度。 LDH只L-A型羟酸有作用，但对D构型的底物无效，LDH 由四个亚基组成，M和H两类亚基可聚合成纯四聚体或杂 四聚体，形成5种同工酶。LDH受重金属、EDTA和草酸 盐的抑制，故EDTA或草酸抗凝血浆也不宜作LDH测定。 过量的丙酮酸或乳酸也可抑制LDH，尤对B亚基的抑制更 明显。
➢ 二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
➢
37度水浴15分钟
➢ NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
➢ 相当于金氏单位0 125 250 500 750 1000
➢ 室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为 1.0cm，用B管调零，读取各管吸光度。以吸光度值为纵坐 标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。
➢ 本法规定37度15分钟产生1umol丙酮酸的酶活力为一个单 位，
➢ 操作步骤：
➢ 1，校正曲线的制作 按表操作
➢ 加入物(ml) B 1 2 3 4 5
➢ 丙酮酸标准液 0 0.025 0.05 0.1 0.15 0.2
➢ 底物缓冲液 0.5 0.475 0.45 0.4 0.35 0.3
➢ 去离子水 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11
➢ 乳酸＋NAD＋――丙酮酸＋NADH＋H＋（正向L-P，逆 向P－L）。
➢ 比色法原理：正向反应生成的丙酮酸与溶于酸的2，4二硝 基苯肼作用生成丙酮酸－二硝基苯腙，后者在酸性环境中 呈草黄色，在碱性溶液中显棕红色，颜色的深浅与丙酮酸 的浓度成正比，与标准浓度的丙酮酸生成的苯腙进行比色， 可推算LDH的活力。
➢ 2，酶活性的测定
➢ 加入物(ml)
测定管 对照管
➢ 血清
0.01
0.01
➢ NAD＋底物缓冲液 0.5
0.5
➢
37度水浴5minFra bibliotek➢ NAD＋溶液
0.1
－
➢
37度水浴15min
➢ 2,4二硝基苯肼
0.5
0.5
➢ NAD＋溶液
－
0.1
➢ 37度水浴15分钟
➢ 0.4mol/L溶液
5.0
5.0
➢ 混匀，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm， 用蒸馏水调零，读取各管吸光度。以测定管与对照管吸光度之差值查 校正曲线，得酶活性。