贵州齿兰环斑病毒的分子鉴定

贵州齿兰环斑病毒的分子鉴定
万晴姣;李欲轲;马骏;乙引;洪鲲
【摘要】In order to provide a reference for effectively controlling Guizhou orchid virus,a suspected odontoglossum ringspot virus (ORSV)was detected by ELISA and isolated from P.amabilis in Guizhou, and purified by Chenopodium amaranticolor.The coat protein (CP)gene of the isolate was then cloned with RT-PCR,sequenced by pMD18-T vector and analyzed by DNAMAN7.0 and MEGA 5.0 softwares. The results showed that the sequence length of CP gene was 477 bp,and encoded a 158-amino acid CP protein.Result of sequence homogenous analysis showed that the isolate shared 9 6%~9 9% homology with 11 reported ORSV isolates,while less than 70% with other three viruses within the same genus (tobamovirus).Therefore,it could be proposed that the virus isolated from P.amabilis was ORSV.%为有效地控制贵州兰花的病毒，将经ELISA方法检测为
齿兰环斑病毒（ORSV）阳性的蝴蝶兰样品摩擦接种至其枯斑寄主苋色藜进行纯化，RT-PCR 克隆并连接至 pMD18-T 载体后测序，用 DNA-MAN7．0和
MEGA5．0软件进行核苷酸序列分析。

结果表明：成功克隆该病毒CP基因，其
序列长度为477 bp，编码158个氨基酸残基；序列同源性分析显示，该分离物的CP基因与已报道的11种ORSV各地分离物序列同源性高达96％～99％，而与
同属其他3种病毒CP基因同源性均低于70％。

证明，贵州蝴蝶兰上感染的病毒
为 ORSV。

【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2014(000)008
【总页数】3页(P96-98)
【关键词】齿兰环斑病毒;外壳蛋白;分子鉴定;蝴蝶兰;贵州
【作者】万晴姣;李欲轲;马骏;乙引;洪鲲
【作者单位】贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001; 贵州省植物生理与发育调控重点实验室，贵州贵阳 550001;贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001;贵州盛世龙方制药股份有限公司，贵州贵阳 550001;贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001; 贵州省植物生理与发育调控重点实验室，贵州贵阳550001;贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001; 贵州省植物生理与发育调控重点实验室，贵州贵阳 550001
【正文语种】中文
【中图分类】S436.8
齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV），隶属烟草花叶病毒属（Tobamovirus）[1]，基因组为（＋）ssRNA。

其外壳蛋白（Coat protein，CP）基因的ORF长度为477bp，编码158个氨基酸残基，蛋白分子量约为18.0KDa[2]，病毒颗粒呈杆状，无包被，长约300nm，宽约18nm，螺旋对称，螺纹明显，颗粒中轴有沟状构造，病毒颗粒分散在细胞质内呈晶格排列[3]。

ORSV 在世界各地商业生产的兰花中分布非常广泛，至少可感染包括文心兰属（Oncidium）在内的35 种兰属，其导致的病变症状主要是花叶、环斑、碎色等[4]。

除此之外，齿兰环斑病毒还常与建兰花叶病毒（CymMV）复合侵染兰花，
使其叶片形成不规则的褪绿、条纹、圆斑甚至坏死等症状，进而导致植株生长不良、花小而少，花期缩短等，使兰花的商业价值降低[1]。

贵州省的兰科植物种类较多，约有71 属206种[5]，是我国兰科植物的主产地之一。

近年来，随着兰花市场和种植规模的不断发展，兰花病虫害的发生也日趋严重，其中以病毒病的危害最重，对兰花产业的健康发展构成极大的威胁。

迄今国内有关ORSV 分子鉴定的研究较少[6－7]，作者前期曾对贵阳地区采集的70余份兰科植物进行了血清学检测，发现ORSV 阳性率高达45.3%，但针对贵州兰花ORSV 尚未见报道。

为此，作者采用血清学和分子生物学技术（如ELISA、RT－PCR 等）
从贵州蝴蝶兰中分离获得ORSV，克隆其CP 基因并对其序列分析，进行分子鉴定，为贵州兰花病毒的检测、防控及兰花种质资源的保护提供理论基础。

1 材料与方法
表1 1种已报道ORSV 的分离物及同属其他3种病毒Table 1 1reported ORSV isolates and the other three viruses within the same genus毒原来源基因序
列登录号Accession number病毒分离物Isolate Source EU683879.1 ORSV－NHRIK1韩国AF406775.1 ORSV－Taiwan 中国台湾AF406772.1 ORSV－South Korea 韩国AY360407.1 ORSV－Gd 中国广东AB693991.1 ORSV－Cipanas Cianjur 印度尼西亚AB693988.1 ORSV－Gunung Sindur 印度尼西亚AJ606106.1 ORSV－KO－3 韩国AF406777.1 ORSV－Singapore 新加坡
AB541505.1 ORSV－ONK1 韩国AB541487.1 ORSV－CYK1 韩国AB693989.1 ORSV－Kebun Raya Bogor 印度尼西亚AF103781.1 RMV－CAB 韩国
AF103780.1 TMV－TOB 韩国AF103778.1 PMMoV－P2韩国
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料从贵阳花卉公司的种植基地采集表现出花叶、褪绿、环斑、碎色等疑似病毒病症状的蝴蝶兰样品，经过ELISA 检测为ORSV 阳性后摩擦接种于苋色
藜（Chenopodium amaranticolor），3次单斑分离后保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名为ORSV－GZ。

1.1.2 试剂 ELISA 检测试剂盒购自美国Agdia公司，植物总RNA 提取试剂（RNAiso Plus）、逆转录PCR 试剂盒（One Step RT－PCR Kit Ver.2）、限制
性内切酶、pMD18－T 载体均购自大连宝生生物（TaKaRa）公司，普通DNA 纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京天根（Tiangen）生化科技有限公司，大肠杆菌DH5α菌株由贵州省植物生理与发育调控重点实验室提供，
常规试剂为分析纯（AR），购自国药等公司。

1.2 病叶总RNA提取
称取0.1g 感染ORSV－GZ 的新鲜苋色黎叶片，选取坏死的叶片经过3次单斑分离后采取活体保存和真空冷冻干燥后低温保存，用RNAiso Plus试剂提取其总RNA，于－80℃保存备用。

1.3 CP基因的克隆与测序
根据Genbank已报道的ORSV 外壳蛋白基因设计引物。

上游引物：ORSV－CP
－F：5′－CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC－3′
（划线处为BamHⅠ酶切位点），下游引物ORSVCP－R：5′－CTCAAGCTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGT－3′（划线处为HindⅢ酶切位点），由上海生工合成。

以提取的总RNA 为模板，进行一步RTPCR，PCR 反应条件：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1 min，反应30个循环；72℃延伸5min。

RT－PCR 产物经过纯化回收后与pMD18－T 载体进行连接，之后转化E.coli DH5α感受态细胞。

菌液PCR 筛选阳性克隆并提取重组质粒送上海生工测序。

1.4 CP基因的同源性与系统进化树
采用DNAMAN7.0软件对ORSV－GZ 和其他11种ORSV 的分离物（表）进行
同源性分析，采用MEGA5.0软件以邻接（Neighbor－Joining）聚类分析方法构建系统进化树[8]。

2 结果与分析
2.1 ORSV－GZ毒原的分离
由图1可见，血清学检测为ORSV 阳性的蝴蝶兰病叶研磨接种于易感寄主苋色藜，大约10d左右接种叶片产生坏死小斑。

图1 蝴蝶兰病样与ORSV 在苋色藜上的症状Fig.1 Leaf symptoms of P.amabilis and C.amaranticolor induced by ORSV注：A，蝴蝶兰病叶正面（褪绿、坏死）；B，蝴蝶兰病叶反面（坏死、凹陷）；C，健康苋色藜；D，接种ORSV－GZ分离物后的苋色藜叶片（枯斑）。

Note：A，right side of P.amabilis leaf （chlorisis，necrosis）；B，reversed side of P.amabilis leaf（necrosis，deboss）；C，healthy C.amaranticolor；D，lesion on
C.amaranticolorinduced by ORSV－GZ.
2.2 ORSVCP 基因的克隆及测序
以感染ORSV－GZ 病叶的总RNA 为模板，利用特异性引物进行RT－PCR，扩增得到约477bp的ORSV CP基因目的片段（图2），条带清晰可用于下一步试验。

由图3 可见，测序得到该基因全长477bp，编码158个氨基酸残基。

图2 ORSV CP 基因RT－PCR产物Fig.2 RT－PCR amplification of the CPgene for ORSV注：1，DNA 分子量标准；2，RT－PCR产物。

Note：1.DNA molecular weight standard；2.RT－PCR product.
图3 ORSVCP 基因序列及推导的氨基酸序列Fig.3 The nucleotide and amino acid sequence of ORSVCPgene
图4 基于ORSV CP 基因序列构建的系统进化树Fig.4 Neighbor－Joining（NJ）tree based on CPgene sequences of ORSV isolates
2.3 ORSV－GZ分离物CP 序列的同源性
将ORSV－GZ分离物与已报道的11种ORSV分离物，以及同属其他3种病毒进行序列比对得出，ORSV－GZ分离物与同种其他病毒序列同源性为96%～99%，其中，与NHRIK1、Taiwan、South Korea、gd分离物核苷酸相似性高达
99.79%，与Cipa nas Cianjur、Gunung Sindur 分离物相似性为99.58%，
与KO3 分离物的相似性为99.37%，与Singapore分离物相似性为99.16%，与ONK1、CYK1分离物相似性为98.95%，与Kebun Raya Bogor分离物相似性为96.86%。

同时，ORSV－GZ分离物与同属其他3种病毒的同源性非常低，其中，TMV 为69.21%，RMV 为53.55%、PMMoV 为64.12%。

据此确定该病毒蝴蝶
兰分离物为ORSV。

2.4 基于CP 基因的系统进化树
如图4 所示，从贵州蝴蝶兰分离的ORSV－GZ与其他11种ORSV 分离物亲缘关系极为接近，而与同属其他3 种病毒亲缘关系较远。

由此可知，ORSVCP 基因在
进化过程中极为保守。

3 结论与讨论
齿兰环斑病毒（ORSV）是对兰科植物危害最为严重的病毒之一，其传播方式主要是病株汁液通过兰科植物机械性伤口传染[3]。

ORSV 在体外具有稳定的存活期，
与侵染兰花的另一重要病毒建兰花叶病毒（CymMV）相比，其防治工作难度更大。

作者对在贵阳地区采集的70余份兰科植物进行了血清学检测发现，在贵州地区ORSV 的发病率较高，这对贵州兰花产业的发展极为不利。

因此，相关部门应当
采取必要措施加强对兰花病毒病的检测及防治。

试验从分子水平对ORSV 贵州蝴蝶兰分离物进行鉴定，该病毒CP 基因的序列长
度为477bp，编码158个氨基酸残基；序列同源性分析显示，该分离物的CP 基
因与已报道的11种ORSV 各地分离物序列同源性高达96%～99%，而与同属其
他3种病毒CP 基因的同源性低于70%，证明贵州蝴蝶兰上获得的病毒分离物为ORSV。

同时，验证了该病毒与其他地区ORSV 分离物具有较近的亲缘关系，反映了其在进化过程中的高度保守性。

这些研究为贵州地区兰花病毒快速检测平台的建立提供了技术支持和理论基础。

[参考文献]
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