单采猪血浆的质量研究

单采猪血浆的质量研究
邓乐君;万华印;李茹冰;江丽;朱晋辉;李健;李伟达;陈灶妹;赵月;陈柯君
【摘要】研究单采猪血浆的质量情况,为建立猪血浆的质量标准提供参考依据.参照中国药典、欧洲药典及猪源性生物制品相关要求检测血浆的外观、pH、渗透压、总蛋白含量、枸橼酸盐含量、钠钾钙离子含量、是否无菌以及对猪细小病毒进行PCR检测方法的建立与应用.结果显示单采血浆外观正常,渗透压、总蛋白含量、枸橼酸盐含量、钾离子、钙离子、钠离子分别为315±34 mOsmol/kg、53.7±3.2 g/L、15.98±4.88 mmol/L、3.00±0.45 mmol/L、2.35±0.38 mmol/L、151.3±22.4 mmol/L,检测结果均符合人血浆制品或者人血浆标准,但pH
7.81±0.21,其与人血浆规定含量稍有差异.单采血浆样品中只有1个样品检出细菌阳性.建立了猪细小病毒特异敏感的PCR检测方法,检测结果显示单采猪血浆猪细小病毒阳性率为0.实验为单采猪血浆质量基本符合现有人血浆或血浆制品质量标准.%The quality of apheresis porcine plasma were analyzed and studied.Visual check,pH,osmolality,content of total protein,sodium citrate,biochemical indicator,sterility test were detected of apheresis porcine plasma,with the reference to the Chinese
Pharmacopoeia,European Pharmacopoeia and related requirements of porcine source biological products.PCR method for the determination of porcine parvovirus (PPV) was developed.Apheresis porcine plasma varied in colour from yellow to light yellow.The mean value of all the sample of osmolality,total protein,sodium citrate and concentration of potassium,sodium and calcium were 315 ± 34 mOsmol/kg,53.7-±3.2
g/L,15.98 ±4.88 mmol/L,3.00 ±0.45 mmol/L,2.35 ±0.38 mmol/L,151.3 ±
22.4 mmol/L,which were up to the standards of human plasma.The mean value of pH was 7.81 ±0.21,which was above the standard of human plasma.Only one sample of apheresis porcine plasma contained bacteria.The developed PCR method had good sensitivity and specificity.By the method,no PPV was detected in all samples.The quality of apheresis porcine plasma corresponded basically with the standards of human plasma or human blood products.
【期刊名称】《科学技术与工程》
【年(卷),期】2017(017)007
【总页数】5页(P134-138)
【关键词】单采猪血浆;总蛋白;聚合酶链式反应(PCR);质量研究
【作者】邓乐君;万华印;李茹冰;江丽;朱晋辉;李健;李伟达;陈灶妹;赵月;陈柯君【作者单位】南方医科大学,广州510515;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广州市众为生物技术有限公司,广州510663;南方医科大学,广州510515;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;南方医科大学,广州510515;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;南方医科大学,广州510515;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广东药科大学,广州510006;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广东药科大学,广州510006;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广东药科大学,广州510006;广州军区广州总医院药剂科,广州510010;广东药科大学,广州510006
【正文语种】中文
【中图分类】R9
动物源性器官、组织、细胞可用于制备人体所需要的各种活性物质和生物材料，其中猪源性生物材料因为其MHC序列与人类高度相似、生物相容性良好[1,2]、来
源丰富已经成为创新药物、医疗器械以及生物制品等的重要来源[3—5]，其质量也决定着生物制品、医疗器械和药物的生物安全性。

猪源纤维蛋白贴是一种新型可降解的快速止血的海绵状片块剂，属于治疗用生物制品第5类，其主要成分纤维蛋
白原通过与凝血酶反应形成网状纤维蛋白凝块封闭创口，另一成分胶原蛋白则具有激活血小板的功能，从而综合达到止血目的。

由于纤维蛋白原被纳入药物行列，胶原蛋白则一直作为器械上市，故猪源纤维蛋白贴为药械结合品，目前国内暂无相同产品上市。

纤维蛋白原来自于血浆，国外上市的同类产品中的纤维蛋白原为人源性，由于人血浆来源有限且可能携带传染性病毒 [6]，而生猪血浆来源丰富，适合大规模的批量化生产，通过严格监控猪只健康以及采集方法可控制血浆质量。

生猪血浆采集的方法目前主要为屠宰取血和单采取血。

屠宰取血为一次性的集中式宰杀取血，血液流经生猪体表易造成微生物污染，血液收集后离心得到血浆，后期成品需进行必要的消毒灭菌。

单采取血通过在生猪前腔静脉留置中心静脉导管，导管连接单采血浆机后体外分离血浆，剩余血细胞回输体内。

单采取血在封闭的采集系统中可实现无菌采血，同时避免了混合血浆导致的病毒交叉污染，留置导管可进行多次采血，对生猪损伤小，技术可行稳定。

现有各国药典或质量标准中并没有统一明确猪血浆质量标准，现结合2015版《中国药典》“血液制品生产人用血浆”、“抗猪T细胞免疫球蛋白”、“人纤维蛋
白原”、“ 人纤维蛋白黏合剂”和欧洲药典中人用血浆的相关要求[7，8]以及生
猪养殖、材料采集过程中的实际情况，对目前生产用的单采猪血浆的pH、总蛋白、枸橼酸钠、钠钾钙离子含量以及是否无菌等指标进行检测。

猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)是猪源性生物制品中最常见的病毒之一，对人体有潜在感染和
病变的风险，因此相关的猪源性生物制品均要求排除PPV。

与该病毒常见的病毒分离鉴定、荧光抗体试验，血凝和血凝抑制试验、中和试验以及乳胶凝集试验等常用的诊断方法相比，PCR作为一种高灵敏性、高特异性和快速简单的检测方法，对检测低剂量病毒有更大的优势，因此有必要建立PPV的PCR检测方法应用于快速检测排除PPV。

单采猪血浆技术作为国内外首创的单采血浆机分离生猪血浆工艺，实现了采集全程的基本无菌，非屠宰式、非麻醉、可多次采集、方法稳定，目前相关技术已申请了专利[9]。

猪源纤维蛋白贴原料来自该工艺采集的单采血浆，最大程度保证了猪源纤维蛋白贴的生物安全性。

通过对单采猪血浆进行的质量研究，与现有的人血浆相关质量标准对比，不仅为生物制品生产用猪血浆的质量标准制定提供参考依据，也为单采猪血浆技术的完善和改进提供实时的反馈。

1.1 仪器
NGL XJC 2000血浆采集机(四川南格尔生物医学股份有限公司)；采血导管为改装过消毒的静脉导管；雷磁PHS—3D pH计(上海精科仪器有限公司)；全自动生化分析仪(罗氏诊断产品上海有限公司)；OSMOMAT 030冰点渗透压仪(德国Gonotec公司)；Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司)；752型紫外可见光分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；Microfuge 18 离心机(美国BECKMAN公司)，MJ MINI PCR测定仪(美国Bio-Rad公司)，水平电泳槽(美国Bio-Rad公司)，紫外凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)
1.2 药品与试剂
ST细胞由苏州良辰生物科技有限公司提供；猪细小病毒AV31株购自中国兽药监察所；猪细小病毒病灭活疫苗(齐鲁动物保健品有限公司，批号为1506003)、猪伪狂犬病活疫苗(哈尔滨维科生物技术开发公司，批号为2016001)，猪瘟活疫苗(广东永顺生物制药股份有限公司，批号为2015052)，2×ES Master Mix(北京康
为世纪生物科技有限公司，批号为00551601)，Tris-饱和苯酚(北京索莱宝生物技术有限公司，批号:20151203)，氯仿(广州试剂厂，批号为20140509)，琼脂糖(美国Invitrogen公司，批号为0000293052)，自制灭菌水，一次性单采血浆分
离器(四川南格尔生物科技有限公司，批号为140410)；枸橼酸钠抗凝剂(四川南格尔生物科技有限公司，200 mL，8.0 g/袋装，批号为20140925)；硫酸铜(天津致远化学试剂有限公司，批号为20131018)，氢氧化钠(广州化学试剂厂，批号为20140602-1)，硫乙醇酸盐流体培养基(广东环凯生物科技有限公司，批号为3103236)，胰酪大豆液体培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司，批号为20150615)。

1.3 血浆样本来源
单采猪血浆来源于经过规范防疫检疫的江西省南昌市养猪场良种生猪，实验随机抽取100头生猪，编号，将生猪保定后，消毒采血部位，用中心静脉导管对生猪进
行静脉穿刺，使用血浆分离机通过单采血浆分离器进行血浆采集，分离器中加入抗凝剂抗凝，每头猪采集约600 mL血浆，采集后放在-20 ℃冻存，共100份。

2.1 一般指标的检测
检测时将血浆置于37oC水浴融化取样，进行以下指标检测：① 外观：样本水浴
融化后，肉眼观察样品外观、颜色、是否有可见异物；② pH[10]；③ 渗透压[11]；
④ 总蛋白[12]采用双缩脲法测定；⑤ 枸橼酸盐的含量测定[13]高效液相色谱法；
⑥ 钠(Na)、钾(K)、钙(Ca)离子生化测定；⑦ 无菌检查[14]。

2.2 猪细小病毒PCR检测方法的建立及应用
2.2.1 病毒的培养及毒力的滴定
ST细胞传代培养至形成50%～70%单层时，接种PPV。

从-70 ℃取出冻存的PPV 病毒毒种，室温融化，37 ℃、5% CO2培养箱吸附1 h，加入含有2% FBS的DMEM培养液至培养箱内培养。

待3/4细胞出现病变时，取出。

将含有病毒及宿
主细胞的培养液，放置于-20 ℃反复冻融3次破碎宿主细胞，释放病毒。

然后，4 ℃离心(3 000 r/min，10 min)去除细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。

用ST
细胞测定PPV病毒的滴度，Reed-Munch方法计算TCID50。

2.2.2 病毒DNA的提取
用酚/氯仿法[15]分别从猪细小病毒、猪细小病毒灭活疫苗、猪瘟活疫苗、猪伪狂犬病活疫苗中提取DNA，同时提取未接种病毒的正常ST细胞培养液DNA作为对照。

2.2.3 PCR扩增及产物分析测序
PPV引物设计参照文献[16]，上游引物：5′-ACACGCATCAAGACTCATAC-3′，
下游引物：5′-TCACTGTGTAGTCCTGTTTG-3′。

PCR扩增反应:利用2×ES Master Mix对提取核酸进行PCR扩增，50μL反应体积，其中Master Mix 25μL，模板2μL，上下游引物各1μL(1 μmol/L),灭菌双蒸水21 μL。

反应条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环;72 ℃延
伸10 min。

反应完成后取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，90 V、30 min后拍照，观察有无预期目标条带。

PCR产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

2.2.4 PCR的敏感性测定
取200 μL的PPV AV31株ST细胞培养物为模板。

2 μL进行10倍系列稀释后，取不同稀释度模板1 μL进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，判断所能扩增的最小稀释度，计算可扩增的最小TCID50。

2.2.5 猪细小病毒PCR检测方法的应用
对采集的单采猪血浆提取的DNA进行检测。

3.1 一般指标的检测结果
(1) 外观：单采猪血浆外观呈淡黄色、黄色，无溶血、无乳糜和无可见异物。

(2) pH、渗透压、总蛋白含量、枸橼酸盐含量、钠钾钙离子测定的结果详见表1。

单采血浆样品中只有1个样品检出细菌阳性。

3.2 PCR结果分析
3.2.1 毒力滴度
PPV AV41株病毒的滴度为104.5 TCID50。

3.2.2 测序鉴定结果
以病毒DNA为模板进行目的片段扩增，得到一条约500 bp的目的条带(见图1)，条带清晰。

测序结果(见图2)目的片段为471 bp，将其进行BLAST在线分析，结果表明该目的条带为PPV基因片段。

3.2.3 PCR特异性鉴定
仅PPV AV41株与猪细小病毒病灭活疫苗可扩增出特异性条带，其他灭活病毒疫
苗及ST细胞没扩增出特异性条带(见图3)。

3.2.4 PCR敏感性测定
经琼脂糖凝胶电泳分析，在模板稀释度10-5处仍可检出特异性条带(见图4)。

经
计算，所能检出的最小TCID50值为0.316。

3.2.5 PPV 的PCR检测方法的应用
取单采血浆和普通血浆制备的DNA模板，采用本试验设计的方法检测，单采血浆检出没有检出PPV 阳性。

由于血浆质量影响着生物制品或药物的安全有效性，因此有必要制定完善的猪血浆质量标准，单采猪血浆技术属于国内首创，其血浆质量是衡量该技术最重要的标准。

欧洲药典中对人血浆的pH要求为6.5～7.6，人体正常的pH为7.35～7.45，过
高或过低的pH都会影响生物制品的制造和使用，单采血浆在采集处理过程中可能由于使用了弱碱性抗凝剂，导致pH偏高，但单采血浆由于采浆机全程自动化控制抗凝剂的用量，pH已经接近于标准范围，抗凝剂的使用是生产过程中必不可少的，因此控制使用量和后期处理是控制该项标准的关键。

血浆渗透压由大分子血浆蛋白
组成的胶体渗透压和由电解质、葡萄糖等小分子物质组成的晶体渗透压两部分构成，因此血浆渗透压直接反映的是血浆中血浆蛋白和电解质的情况，人体正常值约为300 mOsmol/kg，欧洲药典中规定合并人血浆渗透压不少于240 mOsmol/kg，单采血浆的渗透压均符合此标准，说明单采血浆中血浆蛋白含量和电解质情况良好。

从总蛋白含量看，欧洲药典规定人血浆纤维蛋白原含量不低于45 g/L，单采血浆
明显高于该标准，血浆的总蛋白含量对于提取血浆中的纤维蛋白原有重要的意义，在保证血浆无菌且纤维蛋白原含量高的情况下，单采血浆是制备生物材料更好的选择。

单采血浆的样品中只有1个样品中存在细菌，虽然单采血浆技术可最大程度
地避免体外微生物感染，但由于采血环境不是全密封无菌，仍可能存在一定的污染，这也为进一步改进单采血浆技术提供了实时的反馈。

单采血浆由于在采集过程中加入抗凝剂枸橼酸钠进行抗凝，因此钠离子含量有所升高，但仍在正常范围之内[17]。

生物制品中内毒素的存在会影响着血浆的安全性，由于预实验血浆中存在干扰因素，普通的鲎试验凝胶法无法准确检出细菌内毒素，实验中曾尝试用相关的生化分析仪进行检测，但由于其检测结果与药典要求不一致，无法衡量其质量情况，因此后续试验中拟用动态浊度法进行检测，以完善猪血浆的质量标准制定。

在《中国药典》三部(2015年版)中，对用于制备“抗猪T细胞猪免疫球蛋白”的
猪只，要求排除PPV或者是PPV的含量在限度之下，因此对于猪源性材料的质量标准中，有必要建立敏感、特异的方法检测PPV。

ICH关于“来源于人或动物细
胞系的生物技术制品的病毒安全性评价”列举了一些用于检查内源性和外源性病毒的方法，如反转录病毒检测、体外检测、体内检测、抗体产生试验等。

近年来随着分子生物学方法学的发展，以检测微生物基因型为基础的核酸扩增反应正在很多微生物检测中取代传统的检测方法，聚合酶链反应(PCR)试验甚至成为一些病毒检测的金标准，因此通过建立敏感特异性高的PCR检测方法可快速有效地对血浆样品
进行检测。

本实验建立了PPV的PCR检测方法，此方法的敏感性较高，能检测出
最低0.316 TCID50的感染量，且具有特异性。

检测结果表明单采血浆的PPV 阳
性率为0，说明单采血浆来源猪只均没有发现携带猪细小病毒，一方面表明猪场的疾病监控防疫做得较全面，另一方面表明单采血浆在采集过程不仅避免了健康血浆和感染血浆的交叉污染，而且可做到每袋血浆追踪来源，及时处理携带病毒的血浆。

单采血浆在整个采集过程中都保证了用于制备生物制品的血浆生物安全性，因此综上结果表明，单采猪血浆质量总体均符合人血浆质量标准。

血浆的质量是决定着纤维蛋白原类药物和生物材料质量的关键，因此对单采血浆进行质量研究不仅能保证药物和生物制品的生物安全性，同时为日后制定完善猪血浆质量标准奠定了基础，现从pH、渗透压、总蛋白含量、PPV病毒检测等指标研究了单采猪血浆质量，初步建立了以pH、渗透压、总蛋白含量、PPV病毒检测等指标组成的猪血浆质量检测方法体系，为制定更完善的质量标准体系提供了实验依据和较高的参考价值。

*通信作者简介：李茹冰(1971—)，主任技师。

研究方向：药理学和新药研发。

E-mail：****************。

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