荧光检测数据采集系统的研究与实现

荧光检测数据采集系统的研究与实现
The research and realization of Data collecting and data processing in the
measure of Fluorescence.
华南农业大学工程学院(510635) 魏德仙（wei de xian）
摘要: 本文主要介绍了荧光检测的基本原理、方法及检测信号的采集、处理及实
验结果的研究。

Abstract: The basic priciple and method of Fluorescenc measurement are
introduced, Data collecting and data processing in the measure of
Fluorescenc are studied.
关键词: 荧光 检测 数据采集 数据处理
Keywords:Fluorescence..measure .data collecting. data processing
中图分类号：TP399 ,文献标识码：B
一．系统介绍
现代基因检测技术是医学诊断技术的重大进步，而基因检测技术的主要方法是实时荧光定量技术，实时荧光定量技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，应用该技术于本文研究的荧光检测系统中，如图1 标准样品与待测样品分别放入由N个孔的转盘，转盘位于加热的温度控制系统内，转盘以一定的速度转动，当系统在某一段恒定温度需要采样时，计算机检测到转盘的起始位置，光电转换系统对经过的每一试管的荧光信号实现动态检测。

输出信号经过放大，再经过A/D采样，存入计算机，通过串口，送到上位机进一步分析处理。

图 1
二、荧光检测的基本原理和方法
1．原理和方法
所谓实时荧光定量检测技术，是指在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

经典PCR一般分为扩增和检测两个阶段,常用溴乙锭染色,凝胶电泳为定性检测手段。

由于定性实际上就是定量的一种粗约表现，因此只要对检测手段进行改进就可以实现精确定量。

荧光标记技术是分子生物学最常用的标记技术，荧光染料或荧光标记物与扩增产物结合后，被激发的荧光强度和扩增产物成正比。

而根据扩增原理，扩增是呈指数增长，因此在反应体系和反应条件完全一样下，样本含量应与扩增产物的对数成正比，故在一定的条件下荧光强度和样本含量成正比。

图 2
方法1：非特异性染料结合法 利用某些荧光素能和双链DNA结合，结合后的产物具有强的荧光效应（如上图2）。

当扩增结束后，随温度的降低，DNA复性成为双链荧光素与之结合，经激发产生荧光，测定荧光强度，通过内标或外标法求出因数，可以准确定量。

优点：简单易行，成本较低。

缺点：荧光素的结合非特异，荧光素和引物二聚体等有结合，在低样本浓度时影响大，不能进行突变分析和双色分析。

图3
方法2：杂交探针标记法 用荧光素标记在探针上，由探针与靶基因特异性结合成双链而产生荧光效应。

上图3所示是杂交探针标记法的一种，用两种荧光素标记两对探针。

其中一种标记于3`端，一种标记于5`端，同时这两种荧光素其中一种所发荧光恰好是另一种的激发光。

当其分散在液体中时，因为距离大，当一种产生的荧光不足以激发另一种的荧光，当与
靶基因特异结合后，两者距离很小，故激发出另一种荧光。

优点：减少了非特异性误差，可以进行双色分析和突变分析。

优点：定量PCR可以得出准确的定量结果，改变了PCR只用作微量物定性测定的历史，并可进行动态检测和病程疗效分析。

同时让质控的建立成为可能，以保证结果的准确性。

能对基因突变进行分析。

2．计算方法
制作标准样品101 102 103 104 105与待测的样品一起。

y n=km·2n；⑴
y n：测得的第个周期荧光值。

m：样品中的原始基因数（未知数）。

n：扩增的周期（已知）。

k：常数。

求m 值
对⑴取对数得：㏒y n=㏒k +㏒m+n·㏒2
㏒m=㏒y n-㏒k -n·㏒2 ⑵
设：㏒y n-㏒k=A;
-㏒2=B;
有5个样品
则⑵可写为：㏒m1=A1+B1·n⑶
已知关系是线性的前提下，可以画出一条直线，如图4
㏒m
图4
那么直线方程可写为：㏒m=A+B·n ⑷
病人的样本通过加热，扩增到达某一最好周期，此时值已知n，则方程⑷
可求出m或 ㏒m。

三、数据采集与数据处理
转盘以N转/分旋转，转盘内放置M个试管，则每一个试管可用于采样的时间为：T=60／N×M (ms)
当软件检测到转盘的起始位时，检测经过每个试管的脉冲信号，在可采样的时间内，开始连续采样8个点，M个试管的采样值暂存于内存中。

其框图如下：
光检测中断服务程序
初始化启动A/D
Y
是第一个试管? 指针调整
Y
M m
Y N
返回返回
当上位机发出传送数据时，通过串口送入上位机，画出每一个试管的扩增曲线，对曲线进行处理，从曲线中找到扩增的最佳点，即周期n,再由方程⑷求出m值。

根据m
值判断病人样本是阴性或阳性。

四、实验结果
首先我们是对标准样本101 102 103 104 105进行扩增实验，不同次方的样本，变化不同，它们之间的距离还是可以拉开，次方高的先变化，但是曲线变化不够陡，平台区不够明显。

分析原因：1。

试剂的配制，2。

温度控制精度，3。

转盘转速的稳定性。

4。

试管的一致性等影响,有待于进一步实验。

参考文献：1．单片机高级语言C51应用程序设计电子工业出版社。

2．适时荧光定量PCR——一种科学准确的定量方法 Applied biosystems
作者简介：
魏德仙，1962年10月出生，女，汉族，高级工程师，1989年5月毕业于哈工大电气工程系模式识别与智能控制专业，获硕士学位。

从1989年2004年12在广州市光机电工程研究开发中心一直从事计算机应用及工业控制项目的开发与研究。

2004年12至现在在华南农业大学工程学院自动控制教研室。

wei de xian （oct,1962y ），female，Chinese ， Senior engineer，Graduate from Ha er bin institute of technology and got the master degree in the same time，major in pattern recogntion and intelligence control。

I have engaged in reseach and develop of computer application and industry control The Guangzhou Research and Development Center of Optics-Mechanics-Elect ricity Engineering from 1989.5-2004.12。

I am working in south of china agricultural university。

通信地址：广州市天河区龙口东路36号5栋3602房魏德仙
Email:wdx002@。