大黄酚对小鼠脑缺血再灌注损伤沉默信息调节因子3和水通道蛋白4表达的影响

大黄酚对小鼠脑缺血再灌注损伤沉默信息调节因子3和
水通道蛋白4表达的影响
赵薇"王树$李方江'
（1北京市顺义区医院心内科，北京101300；2河北北方学院;3河北北方学院第一附属医院心血管内科）
〔摘要〕目的测定脑组织中沉默信息调节因子（SIRT）3和水通道蛋白（AQP）4的表达，探讨大黄酚对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。

方法随机将昆明小鼠分为空白对照组、假手术组、模型组、大黄酚组。

采用改良的Himori法暂时性阻断双侧颈总动脉建立脑缺血再灌注模型。

观察脑缺血5min再灌注24h后小鼠的行为学表现，计算神经功能损伤评分，应用免疫组化法测定脑组织中沉默信息调节因子（SIRT）3,水通道蛋白（AQP）4的表达，测定脑组织中的超氧化物歧化酶（SOD）活力。

结果大黄酚能明显改善脑缺血再灌注后小鼠的神经功能损伤情况;大黄酚可提高脑组织中SOD的活力；小鼠脑缺血再灌注后24h SIRT3及AQP4表达均增强.而应用大黄酚可以降低AQP4以及上调SIRT3的表达。

SIRT3的表达与SOD活力呈正相关。

结论大黄酚是通过上调SIRT3的表达，增强抗细胞凋亡及SOD的抗氧化作用;下调AQP4的表达，减轻脑缺血后脑水肿的发生，发挥其神经保护作用。

〔关键词〕大黄酚；脑缺血再灌注;超氧化物歧化酶;沉默信息调节因子3；水通道蛋白4
〔中图分类号〕R96〔文献标识码〕A〔文章编号）1005-9202（2019）07-167344;doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2019.07.047
缺血性脑血管疾病（ICVD）已经成为威胁人类健康，影响生存质量的疾病⑴。

近年来，国内外对脑缺血再灌注损伤及保护进行了非常多的实验研究发现诸多因素参与其中，包括氧化应激反应、细胞凋亡、兴奋性氨基酸毒性作用、炎症反应、细胞内钙超载等。

大黄酚对脑缺血再灌注小鼠有神经保护作用,但多为行为学及形态学方面的研究，本实验从组织形态学及分子生物学角度研究大黄酚对脑缺血再灌注小鼠的沉默信息调节因子（SIRT）3及水通道蛋白（AQP）4的作用，探讨大黄酚对缺血性脑血管疾病的神经保护作用及其可能机制。

1材料与方法
1.1主要仪器设备ASP200S脱水机（德国莱卡）；HITACHI UV.9100紫外分光光度计;生物组织包埋机（德国莱卡）:Safire2多功能酶标仪；石蜡切片机（德国莱卡）；3k30高速冷冻离心机（Sigma公司）；真彩病理图文分析系统（德国莱卡）；CX21光学显微镜（0L YMPUS）。

1.2主要药品和试剂大黄酚（生产批号H0796-********,南京建成生物工程研究所）；免抗SIRT3
基金项目：河北省科技攻关计划项目（No.07276166）；河北北方学院自然科学研究项目（No.2010022）
通信作者：李方江（1967-），男，主任医师.硕士生导师.主要从事冠心病介入诊疗研究。

第一作者：赵薇（1988-）,女.硕士，医师，主要从事心脑血管损伤研究。

抗体（生产批号bs-6105R,北京博奥森生物技术有限公司）;AQP4即用型SABC-POD（兔IgG）试剂盒、内源性过氧化物酶阻断液（AR1108）、二氨基联苯胺（DAB）显色剂（武汉博士德生物工程有限公司）；SOD测定试剂盒.bradfonl法蛋白检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3实验药品制备大黄酚的配制：用N-N二甲基甲酰胺溶解大黄酚，吐温80助溶，按N-N二甲基甲酰胺:吐温80：生理盐水=1：1：8配制大黄酚溶液，生理盐水稀释。

配制成1.0mg/kg备用。

3.5%水合氯醛：用生理盐水将3.5g水合氯醛溶解并稀释到100ml。

3%过氧化氢溶液：30%过氧化氢溶液按比例稀释。

现用现配。

1.4模型制备参照改良的Himori法⑺制备小鼠不完全性脑缺血再灌注模型。

小鼠称重后.水合氯醛腹腔注射麻醉。

取仰卧位，固定小鼠四肢，自胸骨柄至下颌骨正中约0.5cm纵向切开，分离肌肉、筋膜、双侧颈总动脉、相邻神经.将事先用液体石蜡浸泡过的黑色手术线穿过双侧颈总动脉.打一松结，在气管上方,以不压迫气管为宜。

准备2条白色手术线液体石蜡浸泡后，分别于左右两侧穿入黑色手术线的结内，埋线后.缝合切口。

手术完毕.于术后48h,拉紧黑色手术线的结，进而起到阻断双侧颈总动脉的效果，造成脑缺血，缺血持续5min左右，轻拉左右两侧白色线，这样使黑线所打的结松开，恢复颈总动脉血流，达到再灌注效果。

在麻醉、预先的手术和缺血再灌注的期间，小鼠肛温维持在（37.0±
0.8)T,且不应用抗生素。

假手术组仅进行手术，不实施缺血再灌注。

1.5分组实验小鼠为昆明小鼠，随机分为4组，大黄酚组、模型组、假手术组、空白对照组。

每组30只，缺血再灌注前30min腹腔注射大黄酚,在缺血再灌注后24h取材。

假手术组与空白对照组均进行手术，但只进行埋线,不实施缺血再灌注。

1.6神经行为学评分观察小鼠行为学变化，于缺血再灌注后参考Garecia等⑻方法进行评分，功能正常时得分最高18分,功能损伤最严重时得分最低3分。

1.7免疫组化各组小鼠均于缺血再灌注后24h 取材,4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋,切片后，得到脑组织石蜡切片标本，用于免疫组化检测。

取脑组织石蜡切片，脱蜡，用3%过氧化氢溶液于室温下10min灭活内源性酶，蒸憎水洗3次。

以0.01mmol/L枸椽酸盐缓冲液浸泡切片,微波炉加热至反复沸腾两次，间隔5min,冷却后磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次。

5%胎牛血清BSA 封闭液于室温下孵育20min。

甩去多余液体。

分别加一抗SIRT3(1：150)4七过夜后，用PBS液洗2min共需3次，再加生物素化山羊抗兔IgG,于37T环境下孵育20min后PBS液洗3次，每次2min o后用SABC试剂，37七环境中孵育20min。

PBS洗4次，每次5min。

DAB显色，然后苏木精复染，酒精脱水.二甲苯透明.中性树胶封片完成，于400倍光学显微镜下观察，应用图像分析软件得出阳性细胞数后分析。

1.8测定SOD活力取新鲜脑组织后，匀浆，生理盐水稀释至10%,离心后取上清液，采用黄瞟吟氧化酶法测定小鼠脑组织SOD活力。

1.9统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析及g检验。

2结果
2.1脑缺血再灌注后神经行为学评分结果空白对照组〔(18.00±0.00)分〕与假手术组〔(18.00±0.00)分〕均未见明显的神经功能损害，与假手术组相比,模型组神经功能损伤评分显著减低，差异有统计学意义〔(5.11±0.90)分,P<0.01〕；与模型组比较,大黄酚组神经功能损伤评分显著增高,差异有统计学意义〔(9.58±1.20)分,P<0.01〕,表明大黄酚可降低小鼠脑缺血再灌注后神经功能损伤。

2.2SOD活力的测定与假手术组〔(209.14土2.41)U/mg〕和空白对照组〔(216.00±2.16)U/mg〕比较,模型组［(99.43±7.78)U/mg〕小鼠脑内SOD 活力显著降低(均P<0.01);与模型组相较，大黄酚组脑组织中SOD活力明显提升，差异有统计学意义〔(12
3.43±8.16)U/mg,P<0.01〕。

2.3免疫组化SIRT3及AQP4蛋白表达空白对照组与假手术组AQP4有少量表达，模型组中AQP4与之相比表达显著增多，而大黄酚组中AQP4较模型组表达明显减少，差异均有统计学意义(均P<0.01)，表明小鼠脑缺血再灌注后脑组织中AQP4的表达增强，大黄酚下调其AQP4的表达(见表1及图1)。

空白对照组及假手术组有少量的SIRT3表达。

模型组SIRT3表达显著增多，大黄酚组SIRT3较模型组表达显著增多，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

表明小鼠脑缺血再灌注后脑组织中SIRT3表达增强，而应用大黄酚可上调SIRT3的表达。

见表1及图2O
表1免疫组化SIRT3及AQP4蛋白表达(x±s,n=30)组别AQP4SIRT3空白对照组 2.74±1.32 2.60±1.06
假手术组 3.99±1.65 3.69±1.51
模型组51.43±7.891}44.43±9.71|}
大黄酚组35.00±5.922)63.71±9.98?) F值158.116131.547
P值<0.01<0.01与假手术组及空白对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P< 0.01
'■*>
>:叮r.'V，.
•'：'-•.•i,，.：.：，，模型组大黄酚组.。

‘八-I」
假手术组空白对照组
图1免疫组化AQP4蛋白表达(DAB,X400)
模型组 大黄酚组
• • • *''-\ > . *1 , ■ t, . '
* . ” i . i J
. ■•
> • , J, f 「憑2 丸 Bi » -V ：,
假手术组 空白对照组
图2免疫组化SIRT3蛋白表达(DAB,x400)
3讨论
大黄酚属羟基蔥醍类，王树等3T)通过空间探
索实验、避暗实验、耐缺氧实验等发现大黄酚对小鼠
脑缺血再灌注有保护作用，通过检测SOD.GSH-PX
活性，显示大黄酚的抗氧化作用是通过提高SOD 的
活性实现的。

颜娟°"近年来的实验表明大黄酚对
脑缺血再灌注损伤的保护作用也可通过抗细胞凋亡
实现，大黄酚具有有抗氧化,耐缺氧，抗细胞凋亡，神
经保护等作用。

脑缺血再灌注后病理生理过程复杂，包括氧化
应激，炎症反应，兴奋性氨基酸毒性作用，细胞内钙
超载，细胞凋亡等。

脑水肿是脑缺血再灌注后非常
显著的组织病理学表现，脑水肿的发生机制尚未完
全阐明，实验研究表明⑴)，水通道蛋白在脑缺血再
灌注后脑水肿的发生发展过程中起到重要作用。

水
通道蛋白(AQP)是一种膜通道蛋白，其特点是对水
有极高的通透性而对其他小分子没有通透性。

AQP
最早是Agre 等I ⑷发现的，至今发现脑组织中存在3
种水通道蛋白:AQP1,AQP4,AQP9,其中AQP4分布
最广泛，功能最强大，参与许多水代谢障碍的调节过
程，尤其是与脑缺血再灌注之后的脑水肿形成过程
密切相关。

研究显示⑴)：通过对AQP4基因敲除小
鼠进行脑缺血再灌注实验，AQP4基因敲除小鼠的
脑水肿及神经损伤更严重，表明AQP4在脑组织的
水平衡调节中起到关键作用，且脑缺血再灌注后的
脑水肿程度与AQP4的表达强度呈正相关。

本研究 结果显示，脑缺血再灌注后脑组织中AQP4的表达 明显增加，而应用大黄酚后AQP4的表达显著减少。

研究显示[，6'，7\脑缺血再灌注后的脑水肿程度与 AQP4的表达强度呈正相关，大黄酚可降低LoVo 细 胞(PKA)活性，下调AQP4及其mRNA 的表达，而环 磷酸腺昔-环磷酸腺昔蛋白激酶(cAMP-PKA)信号 通路在AQP4的表达中起重要作用。

我们推测大黄 酚可能是通过抑制cAMP-PKA 信号转导通路，下调 AQP4的表达，减轻脑缺血再灌注后的脑水肿病变, 从而发挥其神经保护作用。

SIRT3位于线粒体,参与多种细胞的细胞凋亡, 氧化应激，能量代谢等过程。

在缺氧和氧化应激有 关的疾病中起保护作用。

实验I ⑻研究显示:SIRT3 通过去乙酰化超氧化物歧化酶(SOD)2上的赖氨酸 残基，降低细胞中活性氧(ROS)水平,提高细胞的抗 氧化应激的能力。

Porter 等通过对衰老的心肌细 胞进行模拟缺血再灌注损伤.结果显示:SIRT3水平 的降低导致心肌细胞对缺氧的敏感性增强，梗死心 肌体积增大，细胞的相关功能恢复差。

本实验发现, 脑缺血再灌注后小鼠脑组织SOD 活力明显降低， SIRT3表达水平显著下降.给予大黄酚后SOD 活力 及SIRT3水平均显著增强,且二者呈正相关性。

我 们推测大黄酚可能是通过SIRT3参与线粒体蛋白去 乙酰化调节，激活SOD2,降低线粒体内的ROS 水 平，从而达到调节氧化应激反应,抑制细胞凋亡，起 到神经保护的作用。

本实验表明大黄酚是通过 S1RT3参与，降低线粒体内的ROS 水平，调节氧化 应激反应,抑制细胞凋亡，从而起到神经保护的作 用。

大黄酚还可降低神经细胞AQP4的表达，从而 减轻脑缺血再灌注之后脑水肿的发生,但大黄酚下 调AQP4及上调SIRT3表达的机制目前尚不完全 清楚。

4参考文献1 Dorado L,Mill6n M , DAvalos A. Reperfusion therapies for acute ische ­mic stroke :an updatef J] . Curr Cardiol Rev,2014 ； 10(4) ：327-35.2 Gilgun-Sherki Y ,Rosenbaum Z ,Melamed E,eZ al. Antioxidant therapy in acute central nervous system injury ： current state ( J ]. Pharmacol Rev,2002；54(2) ：271-84.3李沙，黄艳秋,游红琴，等.脑缺血再灌注损伤模型大鼠炎性反应 相关信号研究〔J 〕.中国神经免疫学和神经病学杂志,2012；19 (6) ：453-61.4 Harrison DC ,Davis RP,Bond BC,et al. Caspase mRNA expression in a rat model of focal cerebral ischemia 〔J 〕. Brain Res Mol Brain Res, 2001 ；89(1・2) ：13346.5 Wang Q , Kalogeris TJ , Wang al. Antecedent ethanol attenuates cerebral ischemia/reperfusion-induced leukocyte-endothelial adhens-
ive interactions and delayed neuronal death:role of large conduct­ance,Ca2+-activated K+channels(J].Microcirculation,2010；17
(6)：427-3&
6Martin I J.Neuronal cell death in nervous system development and in­jury(review)[Jj.lnt J Mol Med,2011；7(5)：455-78.
7Himori N,Watanabe H.Nohuhide A,et al.Cerebral ischemia model with conscious mice:involvement of NMDA receptor activation and de­rangement of learning and memory ability〔J〕.J Pharmacol Meth, 1990；23(4)：311-27.
8Garecia JH,Wagner S,Liu KF,et al.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.Statistical validation〔J〕.Stroke,1995；26(4)：627-34.
9王树，张力，张丹参，等.大黄酚对脑缺血再灌注小鼠探索功能的影响〔J〕.时珍国医国药,2OO7；18(12)：3Oil-3.
10王树，薛贵平,张丹参，等.大黄酚对脑缺血再灌注小鼠学习记忆障碍及耐缺氧的影响〔J〕.陕西医学杂志.2008；37(4)：402-4. 11王树•张丹参，张力，等.大黄酚对脑缺血再灌注小鼠记忆功能的保护作用〔J〕.中国老年学杂志.2009:29(15):19346
12颜娟.大黄酚脂质体对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及机制研究〔D〕.石家庄:河北医科大学,2014.
13Ribeiro MC,Hirt L,Bogousslavsky J,et al.Time course of Aquaporin
expression after transient focal cerebral ischemia in mice〔J〕.
Neurossci Res,2006;X3(7)：1231-40.
14Arge P,Preston GM.Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane pmtein of28kikxlaltons：member of an ancient channel familyfj].Proc Acad Sei USA,1991；88(24)：111104
15Zeng XN,Xie I丄，Liang R,et al.AQP4knockout aggravates-hlchenii-a/reperfusion injury in mice〔J〕.CNS Neurosci Therapeut,2012；18
(5):388-94.
16Thrane AS,Rappold PM.Fujita T,et al.Critical role of aquaporin-4 (AQP4)in astrocytic Ca2+signaling events elicited by cerebral e- dema〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2011；108(2)：846-51.
17刘青.大黄总蔥醍及其衍生物对LoVc、NRK细胞AQP2、AQP4表达的调节效应与机制〔D〕.西安:第四军医大学,2009.
18Qiu X,Brown K,Hirschev MD al.Calorie restriction reduces oxi­dative stress by SIRT3-mediated SOD2activation[J].Cell Metah, 20i0；12(6)：662-7.
19Porter GA,Urciuoli WR,Brookes PS,e£al.SIRT3deficiency exacer­bates isrhemia-reperfusion injury：implication for aged hearts[J].
Am J Physiol Heart Circ Physiol,2014；306(12):Hl602-9.
[2018-01-13修回〕
(编辑曹梦园)
茸归六君子汤对急性心肌梗死大鼠胃肠道功能的影响
郑丽莉(山东协和学院医学院，山东济南250109)
〔摘要〕目的探讨急性心肌梗死(AMI)对胃肠功能的影响及改善胃肠功能对于AMI治疗的价值.方法将大鼠随机分为假手术组、模型组、消心痛组、复方丹参滴丸组和苇归六君子汤组.每组12只。

采用脂肪乳剂灌胃法和左冠状动脉前降支结扎法复制冠状动脉粥样硬化AMI双模型。

测定胃肠激素胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)、血管活性肽(VIP)、生成抑素(SS)含量:取胃和小肠组织制成匀浆，测定Na+K-ATP酶、Ca"-ATP酶、血栓素(TX)B2、6-酮前列腺素(6-Keto-PGF)]a活性。

结果各给药组血清胃肠激素水平及ATP酶活性显著改善.胃肠TXB2显著降低,6-Keto-PGFla显著升高。

苇归六君子汤组效果优于丹参滴丸组和消心痛组(P<0.05)c结论苇归六君子汤对于AMI大鼠的胃肠功能具有显著保护作用。

〔关键词〕茸归六君子汤;急性心肌梗死；胃肠功能
〔中图分类号〕R285.5〔文献标识码)A〔文章编号〕1005-9202(2(H9)07-“7«G4；dci：10.3969/j.issn.1005-9202.2019.07.048
我国城市居民致死性疾病中.心血管疾病位居前3位.而心血管疾病中.冠心病急性心肌梗死(AMI)则为第一死因⑴。

AMI发生后.相当一部分患者会出现明显的胃肠道反应，而严重的胃肠疾患引起胃冠反射，进一步加重心肌缺血.导致恶性循环。

中医理论认为.人体是有机整体.脏腑之间相互关联，因此，冠心病虽然病位在心，但与脾胃具有密切关系⑵。

六君子汤首见于《医学正传》，具有健脾补气,祛痰化湿之效，治疗脾虚痰湿;现代医学主要
基金项目：山东省中医药管理局科技计划项目(No.2015-312)；山东省高等学校科技计划项目(No.JI6I.K56)
第一作者:郑丽莉(1981-),女.硕士，副教授，主要从事中药复方药理与毒理研究。

应用于胃炎、消化性溃疡等胃肠道疾病的治疗。

<归六君子汤以六君子汤加味当归、川莒，用于脾胃气虚.痰湿兼瘀血阻滞之证候的治疗。

前期实验证实，茸归六君子汤能显著改善AMI大鼠血流动力学、心肌酶、心肌梗死面积和组织形态学等指标.对AMI 具有一定的治疗价值。

本研究继续观察苇归六君子汤对AMI大鼠胃肠功能的影响.探讨AMI与胃肠功能的关系。

1材料与方法
1.1实验动物SD雄性大鼠60只，SPF级,(200±20)g,购自济南市朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号SCXK(鲁)201400070。