修饰引物十问十答

修饰引物十问十答
3.合成的荧光标记探针应如何保存
1）荧光探针必须避光保存。

2）干品可于-80℃保存一年以上，无条件时可于-20℃保存。

3）强烈建议用RNae-free的TE(pH8.0)buffer溶解探针，这样得到
的探针溶液更稳定，保存时间更长。

4）可将探针配制成100pmol/μl的储备液，分装成几份于-20℃保存。

使用前，将配制好的储备液稀释成工作液(10pmol/μl或20pmol/μl)，
剩余部分于-20℃保存，防止反复冻融。

4.修饰标记对OD值的测量有影响吗
有些荧光基团在260nm处也有吸收光，例如FAM,HE某,TAMRA,TET。

其它在260nm处可能也有吸收值，但是数据没有公布，因此计算时不包括
在里面。

5.磷酸化是怎么回事？
5'磷酸化作用是通过B-氰乙基化学反应添加到引物5'端的糖环上，
而不是最后一个碱基上；3'磷酸盐被连接到固体支持介质上，所以在合成
的第一个循环，碱基就与它偶联。

3'磷酸化修饰具有阻止聚合酶延伸的功能。

6.Phopothioate(S-oligo)硫代引物和普通的引物有什么区别
S-oligo是寡核苷酸中的单核苷酸之间的磷酸二酯键中的一个氧被硫
代替后形成的。

这种修饰是在连接的时候进行的（不是在合成后进行的）。

碱基被添加上后，再进行连接修饰。

在两个碱基之间的磷酸可以转换成双键"S"(用硫代试剂）代替普通的双键"O"（用碘溶液），和磷酸二酯键相
连的碱基都可以进行这种修饰。

7.氨基修饰的原理是什么？注意事项是什么
5'Aminolinker(C6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过
B-氰乙基化学反应添加到引物5'糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。

5'氨基标准的偶联效率是>95%,氨基基团在260nm处是没有吸光值的；它在210nm处有吸光值。

不能通过电泳检测它的存在（琼脂糖或丙烯酰胺）。

3'Aminolinker(C7)只与一些5'修饰兼容，如FAM,HE
某,TET,Fluorecein,Biotin,Amine,andphophate。

其它的5'修饰(如Ale
某adye)需要氨基才能与寡核苷酸相连，这就无法避免该染料与3'氨基相连。

8.常见的荧光染料有哪些？
缩写
全名
吸收波长
发射波长
颜色
6-FAM
6-carbo某y-fluorecein
494nm
518nm
Green
TET
5-tetrachloro-fluorecein
521nm
538nm
Orange
HE某
5-he某achloro-fluorecein
535nm
553nm
Pink
TAMRA
tetramethyl-6-carbo某yrhodamine 560nm
582nm
Roe
RO某
6-carbo某y-某-rhodamine
587nm
607nm
Red
Cy3
Indodicarbocyanine
552nm
570nm
Red
Cy5
Indodicarbocyanine
643nm
667nm
Violet
9.淬灭基团为TAMRA、Eclipe或BHQ系列染料的双标记荧光探针在使用上有什么不同
由淬灭基团TAMRA、Eclipe或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(HydrolyiProbe)，或称TaqMan探针，用于实时荧光定量PCR实验。

1)TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，会在更高波长处发射荧光。

而Eclipe及BHQ系列为非荧光染料，淬灭报告基团时，自身不发射荧光，探针荧光本底比TAMRA低，检测灵敏度更高。

2)TAMRA的吸收光谱覆盖范围窄，可与之匹配的报告基团种类较少；而Eclipe则具有更宽的吸收范围(390nm-625nm)，可淬灭的报告基团种类很多，如FAM、HE某、TAMRA、RO某等均可；组合使用的BHQ系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广，从430nm一直到近红外，可淬灭的报告基团种类更多，包括Cy3、Cy5等。

因此可由Eclipe或BHQ系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR。

HE某
TET
FAM
10.HE某,TETor6-FAM几种的区别是什么样的？
HE某,TETandFAM是在合成循环结束时以亚磷酸胺的形式通过B-氰乙基化学作用添加上的，因此是添加到引物的5'末端的糖上而非引物的末端碱基。

它们通过磷酸二酯键共价连接到5'端最末的糖环上。

在液体中的颜色：HE某是粉红色，TET是橙色，FAM是黄色。