小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察与微核的检验
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3.药品： 0.15mg/ml 秋水仙素， 1%柠檬酸三钠，固定液（3 份甲醇，1 份冰
乙酸，临用时现配），Giemsa 染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M 磷酸缓冲液（PBS）pH6.8。 实验准备 溶液配制：
(1) 2.2%柠檬酸三钠：称 11g 柠檬酸三钠到 500ml 蒸馏水中，充分溶解； (2) 1%柠檬酸三钠：取 5g 柠檬酸三钠溶解到 500ml 蒸馏水中，充分溶解； (3) PBS（pH6.8): A 液：取 Na2HPO4 12g 溶于 500ml 蒸水中，充分溶解；
38 44 45 40 36 41 43 39
表 2 对苯二酚对动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率
组别
剂量
动物数 受检细胞数 含微核细胞数 微核率
P值
(g/kg 体重)
(只)
(个)
(个)
(‰)
受试物 120
的核块，而在细胞浆中形成 1 个或数个独立于主核、直径小于主核的 1/3、染色与 主核一致但比主核淡的核小体，因比主核小，故称为微核。微核率的大小与作用因 子的剂量或辐射累积效应呈正相关。
6.凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核 试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正 常核难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个 阶段，此时红细胞的主核已被排出，因胞质内含有核糖体，Giemsa 染色后呈灰蓝色， 成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微 核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选 细胞群。
判断制片优劣的标准，观察时选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染色好的区 域镜检，由低倍镜到高倍镜，并按一定顺序镜检； ⑥此次实验用于制片透明的二甲苯为有毒物质，在透明的过程中要即使将盖子盖 好，注意不要将其泼洒在实验桌或者沾到皮肤，若出现池中情况应该及时用自来 水冲洗； ⑦最后在将涂片制成永久封片时，用注意所用的光学树脂胶应适量，过多容易使树 胶溢出而容易沾在盖玻片表面而使制片清晰度下降，影响观察； ⑧注意微核与颗粒异物、嗜多染红细胞与其他骨髓细胞不同阶段血细胞的区分。
（1）断颈法处死小鼠。剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去 股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出(注意股骨的完整性) ，擦净股骨上的肌肉。
（2）去股骨的髋面，将吸有 2.2%柠檬酸三钠溶液的小注射器的针头插入，反 复数次吹出骨髓细胞，反复吹打直至股骨呈白色(注意吹干净，充分收集骨髓细 胞) ，制成细胞悬液。 3.低渗：
4.检验化学物质能否诱发染色体异常，目前有许多种评价方法。微核的观测是 一种直接有效的方法；
5.微核 （Micronucleus）：微核主要是由外界损害因素(生物、物理、化学)作 用致使细胞染色体丢失或断裂，在有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片或染色体 因纺锤体受损而在分裂过程中行动滞后，分裂末期不能进入主核，形成了主核之外
实验时间 2014 年 4 月 18，25 日 实验室
（一）实验目的 1.学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 2.观察小鼠染色体的形态特征,统计细胞的染色体数目。 3.获得大量客观数据的化学物质遗传毒性评价体系。 4.了解微核发生的机制； 5.掌握微核实验的一般程序和实践意义； 6.掌握对实验动物进行药物处理的一般程序； 7.掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。 （二）实验原理及实验流程或装置示意图 一．实验原理
低倍镜下寻找中期分裂相，然后用高倍镜和油镜观察染色体形态，统计染色体 数目。
可见小鼠的 40 条染色体呈紫红色，微核为细胞中的一个小黑点。
（三）实验设备及材料 实验材料 1.小白鼠（2n=40）（雌雄各半）（30g 最佳） 2.器具：显微镜、注射器、载玻片、树胶、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸及对
苯二酚、秋水仙素、氯化、环磷酰胺、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离 心机、载片、滤纸、白纱布小块等。
（五）、注意事项 ①在实验过程中应防止小牛血清受到污染，胸骨须擦拭干净，以免影响结果配； ②为保证 Giemsa 应用液的染色效果应该先用现配； ③在对离心之后最终得到的小鼠骨髓细胞悬液进行涂片时必须一次涂成，而且用力
要轻,否则会使细胞受到损坏,而且涂片不要过厚或过薄，以免影响观察； ④对于制作好的骨髓细胞涂片即使当日不染色，也应该用 Giemsa 应用液固定后保 存； ⑤对已经制作好的涂片进行制片质量的评定时，须以有核细胞形态、染色完好作为
3.在化学物质中，有很多能引起染色体的异常。染色体是遗传物质的载体并含 有生物体全部的遗传信息，染色体遗传信息的异常可不同程度地影响生物机体的生 存。轻者突变，重者死亡。同样，对人类就会引起各种疾病和损害。对肿瘤细胞的 详细研究表明，大多数肿瘤细胞都存在染色体异常因此，染色体仅出现微小的异常 变化，都可能对人体健康产生非常严重的影响。
根据管底细胞量的多少，加入新配制的固定液 0.3~0.8ml，用吸管打均匀，使 其形成细胞悬液。 7. 滴片：
将预冷的载玻片（0℃冰浴），水平或倾斜 45°角放置，用吸管吸取细胞悬液， 从约 0.5~1m 高处滴 1~2 滴到片子上，用口将其吹干，静置使其干燥。 8. 染色：
将干燥的玻片放入 2ml 吉姆萨原液加入 40ml 磷酸缓冲液（pH6.8）配成的染液 中染色 20min，用磷酸缓冲液（pH6.8）冲洗，晾干后镜检。 9.观察
1.骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血 淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。
2.经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染 色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的 细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在预冷的载片上， 使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。
(四)、实验方法步骤 ①选购小白鼠(体重为 25g—35g)； ②剂量分组：受试物对苯二酚、秋水仙素、氯化汞分别设 3 个剂量，每个剂量组用
5 只小白鼠，各种受试物的剂量设置情况如下所示（单位 mg/Kg）： 对苯二酚： 120、80、40；秋水仙素：10、5、1；氯化汞：3、2、1。另外，用蒸馏水、环磷 酰胺分别作为溶剂对照和阳性物对照组，其中环磷酰胺剂量可为 40mg/kg； ③用腹腔注射 24 小时后，用断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹
B 液：取 KH2PO4 4.55g 溶于 500ml 蒸水中，充分溶解； 使用时,A、B 液等体积混合，即为 pH6.8 的 PBS； (4) 0.15mg/ml 秋水仙素：取秋水仙素 15mg 溶于 100ml 0.85%生理盐水
中，混匀； (5) 75%酒精：取 375ml 95%乙醇，加入 125ml 馏蒸水； （6）小牛血清（灭活）:将滤菌的小牛血清置于 56℃恒温水浴保温 30min 灭活。 灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里； （7）Giemsa 原染液：将 Giemsa 染料 3.8g 置于研钵里研细，再加入甲醇至 375mL 和甘油 125mL，混合均匀，放置 37℃恒温箱中保温 48h。保温期间，振摇 数次，促使染料的充分溶解，取出过滤，两周后用； （8）Giemsa 应用液：取 2ml Giemsa 染液与 40ml 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液混合 而成。（临用） （9）0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）:将已预先配置好的 71.64g/L 磷酸氢二 钠（Na2HPO4·12H2O）、31.21g/L 磷酸二氢钠（NaH2PO4 ·2H2PO4）分别取 51ml 和 49ml，加入 100ml 蒸馏水并混合均匀。
对 苯 二 120
1
酚
80
2
40
3秋水仙 31素1.521
3
氯化汞 3
1
2
2
1
3
阴性对
照蒸馏
水
阳 性 对 40mg/k
照 环 磷 g 体重
酰胺
各受试小鼠 1000 个受检细胞中含微核细胞数 12345678 38 33 35 37 34 35 36 30 28 31 30 32 29 28 33 27 20 25 21 23 28 26 24 22 36 33 32 34 35 31 31 37 29 25 23 26 24 27 25 24 24 21 23 20 19 25 22 19 22 25 20 26 21 23 22 18 16 22 21 19 20 18 17 15 13 17 15 16 14 15 17 13 32143539
将细胞悬液在 1000rpm/min 离心 5min，弃除上清液，留 0.5ml 摇匀。向细胞 液中再加入 1%的柠檬酸三钠溶液 5ml ，用吸管轻轻吹打均匀，在室温下低渗
30min。 低渗期间，配制固定液，即甲醇：冰醋酸为 3:1（v/v)，置 4℃冰箱中备用。
4. 预固定(第 1 次)： 低渗处理后的细胞悬液离心 5 分钟，留 1ml 原液，摇匀。加入新配制的固定
（六）、参考文献
[1]孟紫强，阮爱东，桑楠等.SO2 污染对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的诱发作用.环境科学， 2002，23（4）123-125.
[2]戴灼华，王亚馥，粟翼紋等.遗传学〈第二版〉，2007.
二．实验报告 （一）、实验现象及观察结果
数据
微核试验数据统计总表 1
受试物 剂量 组
mg/Kg 别
本科学生综合性实验报告
学号： 124120469
姓
名： 朱曦鉴
学院： 生命科学学院 专业、班级： 12 级生物技术
实验课程名称： 小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察
教
师：
李云海（副教授）
开 课 学 期： 2013 至 2014 学年 下 学期
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案 实验序号 实验 6 实验名称 小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察与微核的检验
住小鼠的股骨，将小鼠的两股骨取出，剪去和擦净股骨上的肌肉。剪去股骨的髋 面，将吸有 0.85% Nacl 生理等渗液的注射器针头插入，反复几次吹洗出骨髓细 胞并使其混合均匀，制成细胞悬液，再将细胞悬液在 1000 转/分离心 5 分钟，弃 除上清液； ④向离心管中加入少量的小牛血清（约 0.3ml)混匀后，按常规血涂片法涂片，长度 约 2cm—3cm，在空气中晾干。然后将干燥的涂片放入甲醇液中固定 5min； ⑤将固定过的涂片放入 Giemsa 应用液中，染色 20min—30min，然后立即用 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液冲洗，用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染 片以吸附其上的残留水分，促其尽快晾干后放入二甲苯中透明 5min，滴上适量光 学树脂胶，盖上盖玻片后贴好标签； ⑥先后用低、高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀、细胞无损、着色适当的区域， 再在油浸镜下对含微核的有核细胞进行计数； ⑦观察与计数：每只动物计数 1000 个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细 胞数，微核率以千分率表示。统计所得数据可利用统计学软件 SPSS 的单因素方 差分析或 t 检验等方法进行处理，并分析实验结果
液至 6ml，吹打均匀，固定 5 分钟，再在 1000rpm/min 离心 3-5min，去掉上清液。 5. 固定（第 2 次）：
沿离心管壁慢慢加入新配制的固定液 6ml，用吸管轻轻吹打均匀，室温下固定 5min，1000rpm/min 3min，弃去上清；如此反复固定两次（共固定 3 次）。 6.细胞悬液：
7.本法用 Giemsa 染色法观察嗜多染红细胞的微核，嗜多染红细胞呈灰蓝色， 成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核 质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的 1/20～1/5。
二．实验步骤 1.处理：
用 1.5mg/kg 体重剂量，腹腔注射对二甲苯处理小鼠。本次实验的注射量为 0.1ml/10g 体重，即用上述配制的对二甲苯溶液按每 10g 体重注射 0.1ml（每只小 鼠按 30g 体重计算，注射 0.3ml，含对二甲苯 0.045mg）。注射 24 小时后，可以取 骨髓。 2.处死及收集骨髓细胞：
乙酸，临用时现配），Giemsa 染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M 磷酸缓冲液（PBS）pH6.8。 实验准备 溶液配制：
(1) 2.2%柠檬酸三钠：称 11g 柠檬酸三钠到 500ml 蒸馏水中，充分溶解； (2) 1%柠檬酸三钠：取 5g 柠檬酸三钠溶解到 500ml 蒸馏水中，充分溶解； (3) PBS（pH6.8): A 液：取 Na2HPO4 12g 溶于 500ml 蒸水中，充分溶解；
38 44 45 40 36 41 43 39
表 2 对苯二酚对动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率
组别
剂量
动物数 受检细胞数 含微核细胞数 微核率
P值
(g/kg 体重)
(只)
(个)
(个)
(‰)
受试物 120
的核块，而在细胞浆中形成 1 个或数个独立于主核、直径小于主核的 1/3、染色与 主核一致但比主核淡的核小体，因比主核小，故称为微核。微核率的大小与作用因 子的剂量或辐射累积效应呈正相关。
6.凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核 试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正 常核难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个 阶段，此时红细胞的主核已被排出，因胞质内含有核糖体，Giemsa 染色后呈灰蓝色， 成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微 核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选 细胞群。
判断制片优劣的标准，观察时选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染色好的区 域镜检，由低倍镜到高倍镜，并按一定顺序镜检； ⑥此次实验用于制片透明的二甲苯为有毒物质，在透明的过程中要即使将盖子盖 好，注意不要将其泼洒在实验桌或者沾到皮肤，若出现池中情况应该及时用自来 水冲洗； ⑦最后在将涂片制成永久封片时，用注意所用的光学树脂胶应适量，过多容易使树 胶溢出而容易沾在盖玻片表面而使制片清晰度下降，影响观察； ⑧注意微核与颗粒异物、嗜多染红细胞与其他骨髓细胞不同阶段血细胞的区分。
（1）断颈法处死小鼠。剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去 股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出(注意股骨的完整性) ，擦净股骨上的肌肉。
（2）去股骨的髋面，将吸有 2.2%柠檬酸三钠溶液的小注射器的针头插入，反 复数次吹出骨髓细胞，反复吹打直至股骨呈白色(注意吹干净，充分收集骨髓细 胞) ，制成细胞悬液。 3.低渗：
4.检验化学物质能否诱发染色体异常，目前有许多种评价方法。微核的观测是 一种直接有效的方法；
5.微核 （Micronucleus）：微核主要是由外界损害因素(生物、物理、化学)作 用致使细胞染色体丢失或断裂，在有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片或染色体 因纺锤体受损而在分裂过程中行动滞后，分裂末期不能进入主核，形成了主核之外
实验时间 2014 年 4 月 18，25 日 实验室
（一）实验目的 1.学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 2.观察小鼠染色体的形态特征,统计细胞的染色体数目。 3.获得大量客观数据的化学物质遗传毒性评价体系。 4.了解微核发生的机制； 5.掌握微核实验的一般程序和实践意义； 6.掌握对实验动物进行药物处理的一般程序； 7.掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。 （二）实验原理及实验流程或装置示意图 一．实验原理
低倍镜下寻找中期分裂相，然后用高倍镜和油镜观察染色体形态，统计染色体 数目。
可见小鼠的 40 条染色体呈紫红色，微核为细胞中的一个小黑点。
（三）实验设备及材料 实验材料 1.小白鼠（2n=40）（雌雄各半）（30g 最佳） 2.器具：显微镜、注射器、载玻片、树胶、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸及对
苯二酚、秋水仙素、氯化、环磷酰胺、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离 心机、载片、滤纸、白纱布小块等。
（五）、注意事项 ①在实验过程中应防止小牛血清受到污染，胸骨须擦拭干净，以免影响结果配； ②为保证 Giemsa 应用液的染色效果应该先用现配； ③在对离心之后最终得到的小鼠骨髓细胞悬液进行涂片时必须一次涂成，而且用力
要轻,否则会使细胞受到损坏,而且涂片不要过厚或过薄，以免影响观察； ④对于制作好的骨髓细胞涂片即使当日不染色，也应该用 Giemsa 应用液固定后保 存； ⑤对已经制作好的涂片进行制片质量的评定时，须以有核细胞形态、染色完好作为
3.在化学物质中，有很多能引起染色体的异常。染色体是遗传物质的载体并含 有生物体全部的遗传信息，染色体遗传信息的异常可不同程度地影响生物机体的生 存。轻者突变，重者死亡。同样，对人类就会引起各种疾病和损害。对肿瘤细胞的 详细研究表明，大多数肿瘤细胞都存在染色体异常因此，染色体仅出现微小的异常 变化，都可能对人体健康产生非常严重的影响。
根据管底细胞量的多少，加入新配制的固定液 0.3~0.8ml，用吸管打均匀，使 其形成细胞悬液。 7. 滴片：
将预冷的载玻片（0℃冰浴），水平或倾斜 45°角放置，用吸管吸取细胞悬液， 从约 0.5~1m 高处滴 1~2 滴到片子上，用口将其吹干，静置使其干燥。 8. 染色：
将干燥的玻片放入 2ml 吉姆萨原液加入 40ml 磷酸缓冲液（pH6.8）配成的染液 中染色 20min，用磷酸缓冲液（pH6.8）冲洗，晾干后镜检。 9.观察
1.骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血 淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。
2.经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染 色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的 细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在预冷的载片上， 使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。
(四)、实验方法步骤 ①选购小白鼠(体重为 25g—35g)； ②剂量分组：受试物对苯二酚、秋水仙素、氯化汞分别设 3 个剂量，每个剂量组用
5 只小白鼠，各种受试物的剂量设置情况如下所示（单位 mg/Kg）： 对苯二酚： 120、80、40；秋水仙素：10、5、1；氯化汞：3、2、1。另外，用蒸馏水、环磷 酰胺分别作为溶剂对照和阳性物对照组，其中环磷酰胺剂量可为 40mg/kg； ③用腹腔注射 24 小时后，用断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹
B 液：取 KH2PO4 4.55g 溶于 500ml 蒸水中，充分溶解； 使用时,A、B 液等体积混合，即为 pH6.8 的 PBS； (4) 0.15mg/ml 秋水仙素：取秋水仙素 15mg 溶于 100ml 0.85%生理盐水
中，混匀； (5) 75%酒精：取 375ml 95%乙醇，加入 125ml 馏蒸水； （6）小牛血清（灭活）:将滤菌的小牛血清置于 56℃恒温水浴保温 30min 灭活。 灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里； （7）Giemsa 原染液：将 Giemsa 染料 3.8g 置于研钵里研细，再加入甲醇至 375mL 和甘油 125mL，混合均匀，放置 37℃恒温箱中保温 48h。保温期间，振摇 数次，促使染料的充分溶解，取出过滤，两周后用； （8）Giemsa 应用液：取 2ml Giemsa 染液与 40ml 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液混合 而成。（临用） （9）0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）:将已预先配置好的 71.64g/L 磷酸氢二 钠（Na2HPO4·12H2O）、31.21g/L 磷酸二氢钠（NaH2PO4 ·2H2PO4）分别取 51ml 和 49ml，加入 100ml 蒸馏水并混合均匀。
对 苯 二 120
1
酚
80
2
40
3秋水仙 31素1.521
3
氯化汞 3
1
2
2
1
3
阴性对
照蒸馏
水
阳 性 对 40mg/k
照 环 磷 g 体重
酰胺
各受试小鼠 1000 个受检细胞中含微核细胞数 12345678 38 33 35 37 34 35 36 30 28 31 30 32 29 28 33 27 20 25 21 23 28 26 24 22 36 33 32 34 35 31 31 37 29 25 23 26 24 27 25 24 24 21 23 20 19 25 22 19 22 25 20 26 21 23 22 18 16 22 21 19 20 18 17 15 13 17 15 16 14 15 17 13 32143539
将细胞悬液在 1000rpm/min 离心 5min，弃除上清液，留 0.5ml 摇匀。向细胞 液中再加入 1%的柠檬酸三钠溶液 5ml ，用吸管轻轻吹打均匀，在室温下低渗
30min。 低渗期间，配制固定液，即甲醇：冰醋酸为 3:1（v/v)，置 4℃冰箱中备用。
4. 预固定(第 1 次)： 低渗处理后的细胞悬液离心 5 分钟，留 1ml 原液，摇匀。加入新配制的固定
（六）、参考文献
[1]孟紫强，阮爱东，桑楠等.SO2 污染对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的诱发作用.环境科学， 2002，23（4）123-125.
[2]戴灼华，王亚馥，粟翼紋等.遗传学〈第二版〉，2007.
二．实验报告 （一）、实验现象及观察结果
数据
微核试验数据统计总表 1
受试物 剂量 组
mg/Kg 别
本科学生综合性实验报告
学号： 124120469
姓
名： 朱曦鉴
学院： 生命科学学院 专业、班级： 12 级生物技术
实验课程名称： 小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察
教
师：
李云海（副教授）
开 课 学 期： 2013 至 2014 学年 下 学期
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案 实验序号 实验 6 实验名称 小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察与微核的检验
住小鼠的股骨，将小鼠的两股骨取出，剪去和擦净股骨上的肌肉。剪去股骨的髋 面，将吸有 0.85% Nacl 生理等渗液的注射器针头插入，反复几次吹洗出骨髓细 胞并使其混合均匀，制成细胞悬液，再将细胞悬液在 1000 转/分离心 5 分钟，弃 除上清液； ④向离心管中加入少量的小牛血清（约 0.3ml)混匀后，按常规血涂片法涂片，长度 约 2cm—3cm，在空气中晾干。然后将干燥的涂片放入甲醇液中固定 5min； ⑤将固定过的涂片放入 Giemsa 应用液中，染色 20min—30min，然后立即用 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液冲洗，用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染 片以吸附其上的残留水分，促其尽快晾干后放入二甲苯中透明 5min，滴上适量光 学树脂胶，盖上盖玻片后贴好标签； ⑥先后用低、高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀、细胞无损、着色适当的区域， 再在油浸镜下对含微核的有核细胞进行计数； ⑦观察与计数：每只动物计数 1000 个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细 胞数，微核率以千分率表示。统计所得数据可利用统计学软件 SPSS 的单因素方 差分析或 t 检验等方法进行处理，并分析实验结果
液至 6ml，吹打均匀，固定 5 分钟，再在 1000rpm/min 离心 3-5min，去掉上清液。 5. 固定（第 2 次）：
沿离心管壁慢慢加入新配制的固定液 6ml，用吸管轻轻吹打均匀，室温下固定 5min，1000rpm/min 3min，弃去上清；如此反复固定两次（共固定 3 次）。 6.细胞悬液：
7.本法用 Giemsa 染色法观察嗜多染红细胞的微核，嗜多染红细胞呈灰蓝色， 成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核 质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的 1/20～1/5。
二．实验步骤 1.处理：
用 1.5mg/kg 体重剂量，腹腔注射对二甲苯处理小鼠。本次实验的注射量为 0.1ml/10g 体重，即用上述配制的对二甲苯溶液按每 10g 体重注射 0.1ml（每只小 鼠按 30g 体重计算，注射 0.3ml，含对二甲苯 0.045mg）。注射 24 小时后，可以取 骨髓。 2.处死及收集骨髓细胞：