用于质谱鉴定蛋白质胶内酶解方法的优化

胡炜，付强，朱平川，杨丽，刘振方，张
（亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁530005）
明*
摘要：【目的】提高蛋白质胶内酶解效率，减少萃取过程中肽段的损失，增加质谱鉴定的成功率。

【方法】在常规胶
内酶解方法的基础上，优化脱色、酶解、萃取等步骤，包括：用铁氰化钾和硫代硫酸钠对银染胶块脱色，酶解温度提高至55℃，以40 mmol/L碳酸氢铵作为酶切缓冲液，使用50%乙腈（ACN）水溶液3步萃取；并使用一步法胶内酶解探索快速胶内酶解方法。

【结果】使用铁氰化钾和硫代硫酸钠可在短时间内将银染胶块完全脱色，55℃温浴可使酶切时间由
20 h减少为2 h，以40 mmol/L碳酸氢铵作为酶切缓冲液，可省去ZipTip脱盐步骤。

优化后，质谱鉴定率提高30.0%（绝对值），且能明显高酶切效率，使目标肽段更高丰度地呈现出来。

【结论】优化后的胶内酶解法可显著提高蛋白质胶内酶
解的质谱鉴定成功率和肽段覆盖率，其中一步法胶内酶解法有效减少了胶内酶解时间和步骤，可用于高丰度蛋白质中图分类号：Q503文献标识码：A文章编号：2095-1191（2011）07-0802-04 An optimized method of protein s in-gel digestion for mass
spectrometry identification
HU W e i，FU Q i a ng，ZH U P i ng-chuan，YANG Li，LIU Zhen- f a ng，ZH A NG M i ng*（Stat e Key Laboratory for Conservation and Ut ili zation of Subtropical Agriculture Bioresources，Nanning 530005，Chin a）
A bstract：【Objective】The studies were carried out in order to increase the efficiency of protein in-gel digestion，r e-duce the loss of peptides extraction and to increase the ratio of ma ss spectrometry identification. 【Method】The procedures of decoloring，digestion and extraction were optimized using following methods：（i）ferricyanid e and sodium thiosulfat e reagents were used for decoloring of solution，（ii）for enzyme digestion，40 mmol/L ammonium bicarbonate buffer was used at 55℃temperatur e，（iii）three steps extraction was performed with 50% acetonitrile （ACN）and （iv）established one-step in-gel digestion method. 【Result】Compared to the control，use of ferricyanide and sodium thiosulfate reagents decolored the gel pieces quickly and completely. The enzyme digestion time reduced to 2 h from 20 h at 55℃temperatur e，and the Zip- Tip desalting procedure was replaced with 40 mmol/L ammonium bicarbonate as enzmye digestion buffer. The ratio of ma ss spectrometry was increased by 30% （absolut e value），the efficiency of enzyme digestion was also enhanced which resulted in highly abundant peptides. 【Conclusion】The optimized method significantly improved the ratio of mass spectrometry iden- tification and peptides coverage. One-step method significantly reduced the time of in-gel digestion and facilitated fast identification of highly abundant proteins.
Key wor d s：in-gel digestion; mass spectrometry identification; ratio of peptides cover age
0 引言
【研究意义】蛋白质组学研究中，常用双向电泳（Two- d i m e n s i on a l g e l e l e c t rophore s i s，2- D E）分离蛋白质混合物，收集目的蛋白质斑点，经胶内酶解后用于质谱分析以获得蛋白质信息，该分离鉴定方法是目前使用最广泛的蛋白质组学研究手段（刘丽杰等，2007）。

凝胶内微量蛋白质的酶解效率是质谱鉴定成功与否的关键技术，但当前质谱鉴定蛋白质的成本较高，因此，非常有必要探索一种高效的胶内酶解方法，既可减少肽段信息丢失，又有助于获得可信度高、重复性好的蛋白质鉴定结果。

【前人研究进展】在胶内酶解过程中，目标蛋白酶解程度、酶切位点特异性、酶切片断数量、序列覆盖率及酶自切程度、信噪比等，均直接影响搜库结果和蛋白鉴定结果。

1992年，Ro s e n f e l d 等首次发表了胶内酶解方法。

此后，H e ll m a n等（1995）、So s k i c和Godo v a c- Z i mm e rm a nn（2001）对酶解方法进行了改良。

2005年，K um a ra t h asa n等通过对以往胶内酶解方法进行比较，建立一种新的酶解方法（简称K法），获得良好的酶解效果，现已广泛应用于蛋白质组学研究。

【本研究切入点】当前的胶内酶解方法仍然存在酶解费时、肽段提取效率低等缺陷，因此通过对常规胶内酶解方法进行比较，在蛋白质斑点脱色、酶切体系
收稿日期：2011-05-20
基金项目：国家自然科学基金项目(30860192)；广西自然科学基金项目(桂科自0991047)；广西科技基础条件平台建设项目(09-007-01)
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胡炜等：用于质谱鉴定蛋白质胶内酶解方法的优化
和肽段抽提等环节进行改进，对比质谱鉴定成功率和 肽段覆盖率，以评价优化胶内酶解方法的可靠性。

【拟
解决的关键问题】以水牛精子总蛋白质为材料，在常
规胶内酶解方法的基础上，优化脱色、酶解、萃取等步 骤，并使用一步法胶内酶解探索快速胶内酶解方法， 以期使质谱分析的前处理方法更为简化和省时，从而 提高质谱鉴定成功率和肽段覆盖率，为克隆编码基因 序列设计简并引物奠定基础。

μL 振荡洗涤两次，加入现配脱色液（30 mmo l /L 铁氰化 钾，100 mmo l /L 硫代硫酸钠）50~80 μL ，静置2 m i n ，当
胶块由棕黑色变成亮黄色时，迅速加入400 μL Mil- li- Q 水终止反应，弃上清，重新加入400 μL Milli- Q 水 振荡洗涤1次，弃上清；再加入200 μL 40 mmo l /L 碳酸 氢铵，振荡洗涤2 m i n ，弃上清，重复1 次。

然后加入
100~150 μL 纯乙腈，振荡脱水，待胶块变白后，吸弃乙 腈，置于真空浓缩仪中干燥处理10 m i n 。

加入10 μL 胰
蛋白酶工作液（浓度10 ng /μL ），以完全盖住胶块为准， 冰浴45 m i n ，使胶块充分吸收酶解液并溶涨。

吸出管 内多余酶解液，加入10~20 μL 酶解缓冲液（40 mmo l /L 碳酸氢铵，10% ACN ），倒置于55℃烘箱中孵育2~4 h 。

次日，吸出管内酶解液，加入萃取液（50% ACN ，0.1% T FA ）20 μL ，振荡洗涤20 m i n ，吸出酶解液，再加入萃 取液20 μL ，振荡洗涤10 m i n ，并超声波5 m i n ，吸出酶 解液。

合并3次吸出的酶解液，置于真空浓缩仪内抽 干，加入0.1% T F A 水溶液复溶用于质谱鉴定。

（3）一步法胶内酶解：酶解步骤与试验组处理方 法基本相同，加入少量酶解缓冲液2~4 μL ，省略酶解 液萃取步骤，直接吸取管内酶解溶液用于质谱鉴定。

1. 4 质谱分析
将0.5 μL 酶解液分别点入384 孔M ALDI- T OF 靶 中，待样品自然干燥后，加入α- Cyano- 4- h y dro xy c i n - n a m i c a c i d （C H C A ）饱 和 溶 解 基 质（70% ACN ，0.1% T F A ），同时在校准点内加入已知质量数的肽混合物 作为外标校准物。

采用反射模式采集每个靶点的一级 质 谱 信 息（M S ），激 光 强 度 为 4000，扫 描 质 量 范 围 800~4000 D a ，一级质谱扫描完成后，选取10个信号强 度最高的母离子进行二级质谱分析，加速电压2 kV ， 采用碰撞裂解母离子，获取每个母离子的离子碎片指 纹谱。

将一级、二级质谱分析获取的数据导入GPS 软 件，采用M as c o t 算法综合分析，在N C B I 蛋白质数据库
材料与方法
1 1. 1 试验材料
胰蛋白酶（T ry p s i n ）、铁氰化钾、硫代硫酸钠、碳酸 氢铵等购自美国S i gm a - A l d ri ch 公司，三氟乙酸（T F A ） 和 乙 腈（A C N ）购 自 美 国 F i s h e r 公 司 ，4700 S t a nd a rd C a li bra t i on Kit 购自美国AB Sc i e x 公司，其他试剂均为进 口或进口分装产品，试验用水为M illi- Q 超纯水。

质谱 仪为美国AB Sc i e x M ALDI- TOF- TOF 4800 P l u s 型。

1. 2 双向电泳及蛋白质斑点切取 提取水牛精子总蛋白质样品后，加入IPG 胶条水 化液，放入24 cm 胶条槽，在GE H ea l t hc a re IP Gphor III 型等电聚焦电泳仪上进行第一向电泳。

聚焦结束后， 用平衡液平衡两次。

然后配制12%的均一分离胶，将 胶条置于分离胶上进行S DS- P A GE 电泳。

参照Y a n 等
（2000）报道的方法进行硝酸银染色，然后使用Im a g e - Master 7.0软件分析凝胶图谱，选取光密度值接近的 蛋白质斑点作为试验样品。

1. 3 蛋白质胶内酶解 选取光密度值接近的蛋白质斑点，用剪断的T i p
头在每个斑点切取两份等量体积胶块，分别作为对照 组（30个）和试验组（30个）。

对照组样品采用常规方法 处理（Kumarathasan et a l .，2005），试验组采用改进的 方法处理，具体步骤如下：
（1）对照组处理方法：30℃下，蛋白质斑点用40 μL 脱色液（30% ACN ，50 mmo l /L 醋酸铵，p H 7.0）脱色 两次，每次30 m i n ，并间断振荡3~5次，瞬时离心后弃 上清。

然后用乙醇—氯仿洗涤去除S D S 和盐离子，加 入40 μL ACN 脱水3~4 m i n ，弃上清。

用氮气吹干（约 20 m i n ），再向干燥后的胶块中加入10 μL 胰蛋白酶工 作液（50 ng/μL ），室温下预酶解1 h ，使胰蛋白酶完全 渗入胶块中。

然后加入40 μL 酶解缓冲液（0.5 mmo l /L C a C l 2，50 mmo l /L 醋酸铵，p H 7.0），37℃水浴中振荡酶 解16~20 h 。

将酶解液于10000 × g 离心20 s ，收集上清 液，胶块分别用40 μL 抽提液I （0.1% T FA ）、抽提液II
（30% ACN ，0.1% T FA ）和抽提液III （60% ACN ，0.1% T FA ）依次抽提，每种抽提液各抽提1 次，抽提时于 30℃水浴下振荡30 m i n 。

每次抽提后将上清液10000 × g
离心20 s ，收集上清液并以氮气吹干。

将干燥好的肽 结果与分析
2 2. 1 不同胶内酶解方法肽质量指纹图谱的比较
研究结果表明，试验组脱色效率较高，可在1 m i n 全部将胶块由棕黄色脱色至透明，而对照组需要脱色 两次，需1 h 才能使胶块完全脱色。

脱色效率的提高使 银离子几乎不会干扰到后续的酶切体系，在节省时间 的同时，尽可能去除影响酶切干扰因素。

将胰蛋白酶 浓度由50 ng/μL 降至10 ng /μL ，仍未出现酶切不完全
的现象，试验组各样品均获得分布均匀的肽指纹图 谱，说明低浓度（10 ng /μL ）胰蛋白酶相对于胶块内微 50
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· 南 方 农 业 学 报
谱中均出现不同程度的高强度胰酶自切峰(图1)。

高强 度的胰酶自切峰1045 D a 出现时，将减弱目标肽段峰
的强度，在二级质谱鉴定时无法获得较好的离子碎片
图谱，从而影响质谱鉴定的成功率和M as c o t 得分。

2. 2 不同胶内酶解方法质谱鉴定结果的比较
质谱鉴定成功率是胶内酶切方法优劣的最重要 判断标准。

经质谱采集一级和二级质谱数据后，使用
M as c o t 算法搜索N C B I 蛋白质数据库，以M as c o t 得分大
于60作为鉴定成功的标准。

从表1可以看出，对照组的 鉴定成功率为56.7%（17/30），试验组为86.7%（26/30）。

17、27号样品通过两种方法处理均未能成功鉴定，可 能是由于蛋白质本身的复杂修饰或降解所致；对照组 中1、6、9、10、13、16、19、21和22 号样品因肽指纹图
谱 较差未能获得鉴定结果，但采用改进方法能够成功鉴 定，说明改进方法较常规方法能够获得更好的肽指纹 图谱数据，质谱鉴定率可提高30.0%（绝对值）。

表 1 对照组和试验组的质谱鉴定结果
Table 1 MS i dent i f i c a t i on results of the contro l and e xper i m e nt a l group 编号 Code
蛋白质名称 Prot e i n nam e
登录号 A cc ess i on code
M a s cot 得分和肽段覆盖率(%)
Score in Mascot sy stem and rate o f pept i de cov e r a g e 对照组 Cont ro l group 试验组 Test g roup 一步法 One- step m e thod
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
C l ust e r i n
N i e m a nn- P i ck C2 R i bonuc l e ase pancr e a t i c Sorbit o l dehydrog e na se po l y- I g r e c e ptor I mmunog l obul i n J cha i n
－
Heat shock 10kDa prot e i n 1
mCG3431 PHGPx －
Hypothet i c a l prot e i n L OC510569
Es1 prot e i n
Ropppor i n, rhophi li n a ss oc i a t e d prot e i n 1
SP17 prot e i n DN A gyrase subunit A
－
N AD H dehydrogenase 24kDa s ubunit
Tr i o se pho s phat e i s om e r a se 1
PRED I CTED: outer dense f i ber o f s perm t a il s 2 PRED I CTED: a ct i n, gamma, cytopl a s m i c 1
T e kt i n 2
A l pha e no l a se Capping prot e i n musc l e Z- li ne, beta A ctin- r e l a t e d
prot e i n T2
Heat shock 70kDa prot e i n 1 li ke
－
PRED I CTED: s i m il a r to Von Ebner g l a nd prot e i n
G l ut a t hione S- tr a ns f e r a se M 3 Manganous s uperox i de di s mut a se
g i |27806907 g i |28373999 g i |133199 g i |82617550 g i |3914346 g i |32401410
－ g i |119590560 g i |148673102 g i |13195731
－ g i |156120505 g i |77735877 g i |115495919 g i |57619215 g i |123968701
－ g i |1364245 g i |61888856 g i |194033664 g i |94373495 g i |84000189 g i |4927286 g i |28603770 g i |84000199 g i |149732058
－ g i |61884665 g i |114053087 g i |7555818
－ 166(21%) 116(19%) 139(27%) 120(23%) － － 144(15%) － － － 145(31%) － 89(11%) 185(22%) － － 69(5%) － 124(19%) － － 61(5%) 99(12%) 73(5%) 98(14%) － 124(18%) 152(23%) 114(19%) 81(9%) 138(20%) 177(25%) 144(27%) 120(23%) 73(11%) － 131(14%) 98(15%) 82(8%) － 154(31%) 85(5%) 109(14%) 167(20%) 80(8%) － 85(11%) 93(7%) 143(22%) 77(6%) 69(9%) 93(8%) 132(21%) 76(5%) 111(17%) － 235(36%) 215(33%) 139(27%) － 69(8%) 81(12%) 101(17%) 93(13%) －
－
63(4%) － －
－
120(15%) － － 89(10%) －
－
－ － 75(15%) － －
－
86(11%) － 66(7%) － 196(25%) 81(12%) 88(9%)
“－”表示M a s cot 搜库得分低于60，确定为鉴定失败
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胡炜等：用于质谱鉴定蛋白质胶内酶解方法的优化
高，蛋白质鉴定结果的可信度就越高。

从表1可知，对 照组有11个蛋白质M as c o t 搜索得分超过100，试验组
有
14个M as c o t 搜索得分超过100。

在肽段覆盖率方面，试 验组有17个样品的肽段覆盖率大于10%，且28、29号样 品中可达到30%以上，对照组仅有14个样品的大于
10%。

说明优化后的方法能明显提高酶切效率，使目 标肽段更高丰度呈现。

2. 3 一步法胶内酶解质谱鉴定结果
将试验组样品的萃取步骤省略，直接取酶解液点 靶用于质谱鉴定，可成功鉴定13个蛋白质（表1），但 M as c o t 得分和肽段覆盖率相对较低，说明一步法胶内
酶解难以富集到足量的肽段用于质谱鉴定，但该方法 附出来，有可能干扰质谱样品离子化，出现很多杂峰
而丢失目标肽段。

本研究使用50% A C N 水溶液3步萃 取，且第3步使用超声振荡孵育，既能充分提取胶块中 残余的肽段，又避免高有机相的萃取液带来的杂质， 该方法获得的肽段离子化程度较好，离子强度大部分 可以达到6000以上。

在优化胶内酶解方法的基础上，尝试使用一步法 胶内酶解获得质谱数据，其优势在于取消了萃取的繁 琐步骤，酶解完成后直接吸取酶解液用于质谱鉴定。

在节省时间的同时避免了杂质和胰蛋白酶自切峰干 扰，提高了鉴定准确率。

一步法胶内酶解法对高丰度 蛋白质的酶解效率较好，但对低丰度蛋白质斑点存在 肽段释放不完全的现象，离子信号强度偏低，影响了 质谱鉴定的成功率，因此，此方法在鉴定高丰度蛋白 质时可采用。

讨论
在本研究中，试验组与对照组处理方法相比，改
进之处为：（1）脱色液由30% ACN 和50 mmo l /L 醋酸铵
替换为30 mmo l /L 铁氰化钾和100 mmo l /L 硫代硫酸
钠；
（2）胰蛋白酶工作浓度由50 ng/μL 降至10 ng /μL ，酶解 缓冲液使用40 mmo l /L 碳酸氢铵；（3）酶解条件由37℃
升高至55℃，时间由16~20 h 缩短为2~4 h ；（4）由4步抽 提简化为3步同浓度有机相抽提。

在优化的洗涤步骤中，使用M illi- Q 水两次洗涤胶 块，可有效去除银染胶块内的盐离子和醋酸溶液等影 响酶切的杂质。

M ALDI- T OF 质谱是一种软电离技术， 过多的盐分会严重影响样品的离子化过程，酶解缓冲 液不再采用0.5 mmo l /L C a C l 2溶液，改用易降解挥发的 碳酸氢铵，保持胰蛋白酶缓冲体系处于pH 7.0左右，碳 酸氢铵在肽段抽提过程中能挥发降解，省去使用Z i p - T i p 脱盐这一费时费力且成本高昂的步骤。

常规的胶块脱色使用A C N 脱色，但脱色时间长达 1 h ，对于一些银染过重的蛋白质斑点，脱色常不完 全。

脱色后使用乙醇—氯仿洗涤法去除S D S 和盐离子， 可能会在胶块中残留氯仿等有机物，影响酶切反应。

为此，本研究采用30 mmo l /L 铁氰化钾和100 mmo l /L 硫 代硫酸钠脱色，胶块由黑褐色变成透明只需1 m i n ；为 洗脱残留的铁氰化钾和硫代硫酸钠，可使用40 mmo l /L 碳酸氢铵多次洗涤残留有机物，使酶切效率提高。

胰 蛋白酶的最适温度为37℃，在此温度下胰蛋白酶不易 短时间内失活。

优化的方法采用55℃高温酶解2 h ，不 但高温下胰蛋白酶易失活，而且还可提高酶解效率。

经实验证实，55℃高温下酶解可显著缩短胶内酶解时 间，而酶切效率并未下降。

常规的胶内酶解方法要进行肽段萃取，通过逐步 提高抽提液中乙腈浓度将胶块内残余的肽段萃取出 3
结论
通过与常规方法比较，优化后的胶内酶解方法可
提高蛋白质质谱鉴定成功率30.0%（绝对值），银染的样 品鉴定成功率可达86.7%，有效减少杂质和胰蛋白酶 自切峰的干扰，提高目标肽段的离子强度，缩短胶内酶 解时间10倍以上；且能明显高酶切效率，使目标肽段更 高丰度地呈现出来，为设计简并克隆编码基因提供了 有价值的肽段序列。

而采用一步法胶内酶切后用于质 谱鉴定可以实现高丰度蛋白质的快速质谱鉴定。

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（责任编辑 兰宗宝）。