甜果螨的饲养及其线粒体基因组测序与全序列分析

甜果螨的饲养及其线粒体基因组测序与全序列分析目的:探讨甜果螨(Carpoglyphus lactis)的饲养条件并对甜果螨进行纯培养,扩大甜果螨的样本量,保证后续实验顺利进行;测定甜果螨线粒体基因组全序列,完成全序列的注释和分析,并与部分无气门亚目螨类线粒体基因组进行比较分析。

方法:(1)采集干果商店的储藏干果,分离其中孳生的粉螨。

(2)制备3种不同配方的甜果螨饲养料,各挑入上述分离所得的200只甜果螨,于同一人工气候箱内进行人工饲养,4周后统计甜果螨增殖倍数。

选择其中1种饲养料,设置33种温湿度条件,观察每种温湿度条件下甜果螨雌成螨6天时存活率及6天日均产卵量。

(3)将上述饲养所得的甜果螨,用传统的酚氯仿抽提法和试剂盒提取法提取甜果螨基因组DNA,采用节肢动物和螨类线粒体基因的通用引物,PCR扩增出线粒体cox1、cob、rrnS和nad4-nad5目的基因的部分序列,克隆纯化后送至生物公司进行双向测序,得到目的基因序列,再分别设计种特异性上、下游引物进行Long-PCR扩增和步移法测序,直至测出线粒体基因组全序列。

应用Seqman、SEQUIN 9.0、tRNAscan等生物信息学软件,对甜果螨线粒体基因组的基因结构和排列、碱基含量、PCGs基因、密码子的使用、核糖体RNA基因、转运RNA基因和非编码基因进行注释及二级结构的预测分析。

最后与GenBank数据库中其他已测的4种无气门亚目螨线粒体基因组全序列进行无气门亚目螨类线粒体基因组的比较分析。

结果:(1)从61种储藏干果样本中共分离出粉螨19种,隶属于6科16属,孳生的干果种类最多的螨种为甜果螨,其次为害嗜鳞螨、家食甜螨和腐食酪螨。

(2)培养4周后,3种不同配方饲养料中甜果螨的平均孳生密度分别为
5598.62只/g、2013.15只/g、411.23只/g,增殖倍数分别约为1400倍、500倍、100倍。

甜果螨雌成螨在相对湿度低于66%水平时,各温度梯度下的存活率皆为0,在15~35℃,湿度与甜果螨存活率和日均产卵量呈正相关性。

(3)甜果螨(ctis)线粒体基因组总长为14060bp,为典型的闭合双链DNA 分子,共由37个基因组成,包括13个蛋白质编码基因(PCGs)、22个转运RNA基因和2个核糖体RNA基因,甜果螨线粒体基因组还包括1个最大的非编码区(large non-coding region,LNR)。

与粉螨科的椭圆食粉螨和伯氏嗜木螨以及麦食螨科的粉尘螨和屋尘螨比对分析发现,果螨科的甜果螨线粒体基因组没有出现基因的缺失与重排,基因排序与上述4种螨完全一致。

结论:(1)本研究筛选出了快速培养甜果螨的适宜配方,探究了甜果螨纯培养的实验室条件,为粉螨的饲养提供了参考,也为干果储藏及粉螨防治提供了依据。

(2)本研究获得并注释分析了甜果螨线粒体基因组全序列,是果螨科螨类线粒体基因组全序列的首次报道。

为推进无气门亚目物种线粒体基因组的测序与注释以及无气门亚目分子系统学的发展积累了资料。