实验八 紫外吸收法检测DNA的浓度与纯度

实验八、紫外吸收法检测DNA的浓度与纯度
一、实验目的
学会利用紫外分光光度计测定样品的吸光度，从而测出DNA的浓度与纯度。

二、实验原理
DNA的吸收峰在260nm，蛋白质的吸收峰在280nm。

1 μg/ml标准DNA样品A260=0.02，因此，A260=1时，双链DNA含量为50μg/ml；单链DNA与RNA含量为40μg/ml；寡聚核苷酸的含量为30μg/ml。

一般来说，纯净的DNA 其A260/A280的比值约为1.8，大于1.8表明样品中RNA污染严重，小于1.6说明有蛋白质或苯酚污染；纯净的RNA A260/A280的比值约为2.0，在样品中若含有蛋白质，会使A260/A280的比值下降。

三、实验材料
紫外分光光度计、比色皿、移液枪、实验七中获得的质粒DNA
四、实验步骤
1、选取合适的按键。

待测定样品为dsDNA（如PCR产物），按下键“7/dsDNA”。

待测定样品为ssDNA（如反转录合成的第一链cDNA产物），按下键“8/ssDNA”。

待测定样品为RNA，按下键“9/RNA”。

待测定样品为Oligo（如PCR引物），按下键“6/Oligo”。

2、将空白对照置入样品孔。

注意：空白对照是空白液，并非所有情况都是水。

例如，用Tris溶液溶解DNA样品，则要用Tris液做空白对照。

3、按下“Blank”键。

仪器记录空白对照，设置为0.000A。

4、将样品置入样品孔，按下“Sample”键，仪器显示样品的吸光度和浓度值，以及其他相关参考比值。

五、实验结果与分析
A260/A280=1.118，DNA浓度86.45。

A260/A280小于1.6，说明蛋白质或苯酚污染严重，这可能是在制备质粒DNA时加入的酚/氯仿不足，或加入酚/氯仿后没有混合均匀等原因。

DNA浓度偏低，可能是实验的多次弃上清过程中存在损耗。

六、思考题
问：利用紫外-可见分光光度计测得的结果比实际浓度偏高还是偏低？为什么？
答：核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰。

吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。

但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量，故结果偏高。