酶活性

实验33 过氧化氢酶的活性测定
目的意义
过氧化氢酶（catalase ，CAT ）普遍存在于植物所有的组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定联系，故常加以测定。

本实验的目的在于掌握过氧化氢酶活性测定的方法、原理及操作技术。

一、高锰酸钾滴定法
（一）原理
过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂，因此，可根据H 2O 2的消耗量或O 2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的H 2O 2溶液，经酶促反应后，用标准KMnO 4溶液（在酸性条件下）滴定多余的H 2O 2，即可求出消耗的H 2O 2的量。

5H 2O 2 + 2KMn04 + 4H 2SO 4 ──→ 502 + 2KHS04 + 8H 20 + 2MnS04
（二）实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：小麦叶片。

2. 仪器：恒温水浴、研钵、三角瓶、酸式滴定管、容量瓶等。

3. 试剂：
（1）10％ H 2SO 4
（2）0.2mol ·L -1 pH 7.8磷酸缓冲液
（3）0.lmol ·L -1 KMnO 4标准液：称取KMnO 4（AR ）3.1605g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制
成1000mL ，再用0.lmol ·L -1草酸溶液标定。

（4）0.lmol ·L -1 H 2O 2：市售30％ H 2O 2大约等于17.6 mol ·L -1，取30％ H 2O 2溶液
5.68mL ，稀释至1000mL ，用标准0.l mol ·L -1 KMnO 4溶液（在酸性条件下）进行标定。

（5）0.lmol ·L -1草酸：称取优级纯H 2C 2O 4·2H 2O 12.607g ，用蒸馏水溶解后，定容至
1000mL 。

（三）操作步骤
1. 酶液提取：称取小麦叶片
2.5g 加入pH 7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容至刻度，4000rpm 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2. 酶活测定：取50mL 三角瓶4个（2个测定，2个对照），测定瓶加入酶液2.5mL ，
对照瓶加煮死酶液2.5mL ，再加入2.5mL 0.lmol ·L -1 H 2O 2，同时计时，于30℃恒温水浴中
保温10min ，立即加入10％ H 2SO 4 2.5mL 。

用0.l mol ·L -1 KMnO 4标准溶液滴定，至出现粉
红色（在30min 内不消失）为终点。

（四）结果计算
过氧化氢酶活性单位（U ）定义为1g 鲜样1min 分解1mg H 2O 2所需的酶量。

()t W V V B A S
T
⨯⨯⨯-=7.1过氧化氢酶活性
式中：A 为对照 KMnO 4滴定值（mL ）；B 为酶反应后KMnO 4滴定值（mL ）；T V 为提取酶
液总量（mL ）；S V 为反应时所用酶液量（mL ）；1.7为1mL 0.1mol ·L -1 KMnO 4相当于1.7mg
H 2O 2；W 为样品鲜重（g ）；t 为反应时间（min ）。

【附注】
所用KMnO 4溶液及H 2O 2溶液临用前要经过重新标定。

二、紫外吸收法
（一）原理
H 2O 2在240nm 波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解H 2O 2，使反应溶液吸光度（A 240）随反应时间而降低。

根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

（二）实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：小麦叶片或其他植物组织。

2. 仪器：紫外分光光度计、离心机、水浴锅、研钵、容量瓶、移液管、试管等。

3. 试剂：
（1）0.2mol ·L -1 pH 7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）
（2）0.1mol ·L -1 H 2O 2（用0.1mol ·L -1 KmnO 4标定）
（三）操作步骤
1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片0.5g ，置研钵中，加入2～3mL 4℃下预冷的pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容至刻度。

混合均匀，将容量瓶置5℃冰箱中静置10min ，取上部澄清液4000rpm 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。

2. 测定：取3支试管，其中2支为样品测定管（取平均值），1支为空白管（加煮死
酶液），按下表添加试剂。

25℃预热后，逐管加入0.3mL 0.1mol ·L -1 H 2O 2，每加完1管立
即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm 下测定消光值，每隔lmin 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，计算酶活性。

（四）结果计算
过氧化氢酶活性单位（U ）定义为1g 鲜样1min 内A 240减少0.1所需的酶量。

W
t V V A T ⨯⨯⨯⨯∆=12401.0过氧化氢酶活性 式中：240A ∆为测定管与对照管消光值之差；T V 为粗酶提取液总体积（mL ）；1V 为测定用粗酶液体积（mL ）；0.1为A 240每下降0.1为1个酶活单位（U ）；t 为加H 2O 2到最后一次读数时间（min ）；W 为样品鲜重（g ）。

【附注】
凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。

实验34 植物组织中过氧化物酶活性的测定
目的意义
植物组织中过氧化物酶（peroxidase，POD）活性与植物的生长发育有很大关系。

过氧化物酶一般在老化的组织中活性较强，在幼嫩的组织中较弱，这是因为过氧化物酶能使植物组织中所含的C6～C8的化合物转化为木质素而增强组织木质化的程度。

而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增强。

另外发现植物组织中该酶的活性与植物抗性也有较大的相关性。

因此，过氧化物酶活性测定常作为植物组织老化和抗性的一个诊断指标。

本实验的目的是学习植物组织过氧化物酶活性的测定方法、原理及操作技术。

一、联苯胺比色法
（一）原理
在过氧化物酶作用下，过氧化氢分解为水和活性氧，活性氧可氧化联苯胺生成一种蓝色化合物。

生成的蓝色化合物在580nm波长处有最大吸收峰，光吸收值与生成的发色物质浓度在一定范围内成线性关系，可用比色法测定。

而一定时间内蓝色物质生成量与反应体系中过氧化氢的分解速率成正相关，因此可用蓝色物质浓度在一定时间内的变化（反应系统中光吸收的变化）来表示过氧化物酶的活性。

本法快速、简便、灵敏度高、重复性好，且不需要特别的仪器，适于一般实验室进行大批量测定。

（二）实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：各种植物材料均可。

2. 仪器：分光光度计、离心机、恒温水浴、天平、研钵、试管、容量瓶、移液管、剪刀等。

3. 试剂：
（1）0.1mol·L-1 pH 8.5 Tris-HCl缓冲液：称取Tris（3－羟甲基氨基甲烷）1.21g 溶于80mL 蒸馏水中，用1M HCl调节pH至8.5，用蒸馏水定容至100mL。

（2）0.1mol·L-1 H2O2溶液：吸取1mL 30％ H2O2稀释至100mL。

（3）0.005mol·L-1联苯胺乙酸—乙酸钠溶液：在200mL烧杯中，先加入2/3体积的蒸馏水及2.3mL冰乙酸和184mg联苯胺。

在50～60℃水浴中加热溶解，然后加入5.45g无水乙酸钠，待完全溶解后冷却，加水至200mL。

（三）操作步骤
1. 酶液提取：采取新鲜植物样品，洗净、吸干、剪碎，称取1g，加入0.1mol·L-1 pH 8.5 Tris-HCl缓冲液5mL及少量石英砂，在研钵中研磨成匀浆。

然后转入离心管中，用另外5mL缓冲液冲洗研钵，洗液一并转入离心管，平衡后4000rpm离心15min。

上清液即为酶提取液，暂时不用可贮于冰箱中保存。

测定前再稀释300～500倍。

2. 酶活性测定：吸取已稀释酶液1mL加入干净试管中，再加2mL联苯胺乙酸—乙酸钠溶液，摇匀，在28～32℃水浴中保温3～5min（室温高于24℃时不必保温），以此调节分光光度计580nm波长零点。

取出比色杯，向其中仔细加入1mL 0.1mol·L-1 H2O2，立即计时，以塑料薄膜覆盖比色杯口，用拇指按住，上、下颠倒二次以摇匀，并迅速放入比色槽中，够15s时（从加入H2O2算起）读取OD值，间隔30s后（从加入H2O2算起45s），再读一次OD值（此间可见表针向左漂移）。

（四）结果计算
过氧化物酶活性单位（U）定义为1mg鲜样1min内OD值升高1个单位所需的酶量。

1000
2OD ⨯⨯⨯=W V △过氧化物酶活性 式中:OD ∆为45s 与15s 的OD 值之差；2为分钟换算值；V 为酶液总体积（mL ）；W 为样品重（g ）。

【附注】
过氧化氢与反应系统接触后，立即产生蓝色物质，吸光值读数不断上升。

在开始反应的45～60s 之内，吸光值成直线上升；但随反应时间延长，吸光值变化减缓。

故取第15～45s 间的值较为适宜。

二、愈创木酚比色法
（一）原理
在过氧化物酶催化下，过氧化氢将愈创木酚氧化成茶褐色产物，其在470nm 处有最大吸收峰。

该生成物颜色的深浅与其浓度成线性关系，故可用分光光度计测量生成物的含量，间接测定过氧化物酶的活性。

（二）实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：各种植物材料均可。

2. 仪器：分光光度计、离心机、磁力搅拌器、秒表、研钵、容量瓶、量筒、试管、移液管等。

3. 试剂：
（1）10mmol ·L -1 pH 7.0磷酸缓冲液：准确称取0.156g NaH 2PO 4•2H 2O ，溶解后定容至
100mL ，即为A 液；准确称取0.35g Na 2HPO 4·12H 2O ，溶解后定容至100mL ，即为B 液。

取A
液39mL 和B 液61mL 混匀，即为10mmol ·L -1 pH 7.0磷酸缓冲液。

（2）40mmol ·L -1 H 2O 2：吸取0.318mL 30％ H 2O 2（比重 1.438g ·mL -1），加水定容至
100mL 。

（3）20mmol ·L -1愈创木酚：吸取0.2mL 愈创木酚，加水定容至100mL ，贮于棕色瓶中。

（4）20％三氯乙酸：称取20g 三氯乙酸，用蒸馏水溶解后定容至100mL 。

（三）操作步骤
1. 酶液制备：
称取植物材料0.3～1.0g ，加入适量的pH 7.8磷酸缓冲液，充分研磨至无粗纤维为止，分装在两个塑料小离心管中，再用pH 7.8磷酸缓冲液洗净研钵，洗液一并转入小离心管，10000rpm 离心20min ，上清液即为酶提取液。

或称取植物材料1.0g ，充分研磨至匀浆，加入pH 7.8磷酸缓冲液6mL ，完全转移至离心管中，4000rpm 离心10min ，此步离心液可用于丙二醛含量测定，剩余部分15000rpm 再离心10min ，上清液冷冻保存，可用于POD 、SOD 活性测定。

2. 酶活性测定：
取两只试管，1支为测定管（可设重复），另1支为对照管，按下表加入试剂，配成POD 反应体系（随酶量的增减，相应改变加入磷酸缓冲液的量，以保持总体积不变）。

摇匀，放入34℃水浴中保温3min 后，加入60μL 左右三氯乙酸，摇匀，以对照管作用液为空白，在470nm 波长下比色，读取OD 值。

试 剂 磷酸缓冲液 愈创木酚
H 2O 2 酶提取液 蒸馏水 OD 值 测定管
2.91mL 0.05mL 0.02mL 0.02mL — 对照管 2.91mL 0.05mL 0.02mL — 0.02mL
（四）结果计算
过氧化物酶活性单位（U ）定义为1g 鲜样1min 内470nm 处吸光值升高1 个单位所需的酶量。

2
1470V V t W OD ⨯⨯=过氧化物酶活性 式中：470OD 为470nm 下的OD 值；W 为样品重（g ）；t 为反应时间（min ）；1V 为提取时酶液体积（mL ）；2V 为反应时酶液体积（mL ）。

【附注】
1. 反应液中加入酶液的数量视酶活性而定，可根据显色情况增加或减少。

2. 加入三氯乙酸是为了终止酶的活性，故要在保温后加入。

具体加入数量应以OD 470相对稳定为度，如随时间延长，比色液一直在加深（OD 470增大），即说明加入的三氯乙酸量少，此时应适量增加。

适用范围一般为40～80μL 。

3. 随加入酶液及三氯乙酸量的增减应相应改变加入磷酸缓冲液的量，以维持总体积不变。

实验35 植物组织中超氧化物歧化酶活性的测定
一、目的意义
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，SOD ）是需氧生物中普遍存在的一种金属酶。

它与过氧化氢酶（CAT ）、过氧化物酶（POD ）统称为保护酶系统，三者协同一致，防御活性氧（如超氧自由基）或其它过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而抵御不良环境的影响和细胞衰老。

因此，常用于植物抗性生理和细胞衰老的研究。

本实验的目的是学习掌握超氧化物歧化酶活性的测定原理与方法。

二、原理
超氧化物歧化酶可以催化氧自由基发生歧化反应，生成过氧化氢和水；过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化为无害的分子氧和水。

超氧化物歧化酶活性的测定方法很多，如氮蓝四唑（NBT ）光化还原法、细胞色素C 氧化法、邻苯三酚自氧化法、化学发光法等等。

本实验采用NBT 光化还原法。

氮蓝四唑全称为氯化硝基四氮唑蓝，又称四唑蓝，其水溶液为淡黄色。

照光时，反应体系产生氧自由基，可将NBT 还原为蓝色的甲月簪，该产物在560nm 处有一最大吸收峰。

当有SOD 存在时， 它可以清除氧自由基而抑制此反应。

SOD 活性越强，抑制作用越明显，根据抑制的程度可以测定SOD 的活性。

同时，在反应体系中加入核黄素和甲硫氨酸，前者可被光还原，并在有氧条件下再氧化产生超氧自由基，后者可保持酶的活性。

通常，以抑制NBT 光化还原50％时的酶量作为一个酶活单位。

三、实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：各种植物叶片。

2. 仪器：分光光度计、人工智能气候箱（光强达到5000～7000Lx 的照光条件）、台式高速离心机、研钵、小烧杯、具盖白瓷盘等。

3. 试剂：
（1）50mmol ·L -1 pH 7.8磷酸缓冲液
（2）提取介质：50mmol ·L -1 pH 7.8磷酸缓冲液，内含1％不可溶聚乙烯吡咯烷酮。

（3）反应介质：50mmol ·L -1 pH 7.8磷酸缓冲液，内含77.12μmol ·L -1 NBT 、
0.1mmol ·L -1 EDTA （乙二胺四乙酸）、13.37mmol ·L -1 Met （甲硫氨酸）。

（4）80.2μmol ·L -1核黄素溶液：用含0.10mmol ·L -1 EDTA 的50mmol ·L -1 pH 7.8磷
酸缓冲液配制。

四、操作步骤
1. 酶液提取：取待测植物叶片剪碎（去掉叶脉），称取0.2g ，加2mL 提取介质研磨成匀浆，15000rpm 离心10min ，上清液即为酶提取液。

2. 酶活测定：取3支干洁小烧杯，按下表添加试剂（如需要设置重复或增加不同条件处理，可根据需要增加组合）。

将2号置于暗中，1、3号置于人工智能气候箱中照光10min 。

照光结束后迅速放入白瓷盘内，盖盖，避免见光。

以2号中的反应液调零，测定1、3号反应液在560nm 下的OD 值。

编 号
1 2 3 反应介质（mL ）
酶提取液（mL ）
核黄素溶液(mL)
磷酸缓冲液（mL ）
备 注 3.9 0.01 0.1 — 照光用于酶活测定 3.9 — 0.1 0.01 避光用于调零 3.9 — 0.1 0.01 照光用作对照
五、结果计算
超氧化物歧化酶活性单位（U ）定义为1g 鲜样1h 内抑制NBT 还原50％所需的酶量。

%
5001.00⨯⨯⨯⨯⨯∆=t W D V OD 超氧化物歧化酶活性 式中：OD ∆为对照与测定OD 值之差；V 为酶提取液总体积（mL ）；0D 为对照的OD 值；W 为样品重（g ）；t 为照光时间（h ）；0.01为加入酶液体积（mL ）；50％为NBT 光化还原50％。

【附注】
1. 不同材料、同一材料不同生育时期，SOD 活性不同，实验中所加酶液的具体数量需要经过预做才能决定。

2. 可将丙二醛含量测定、SOD 活性测定、POD 活性测定设计成系列实验，可一次性地称取1g 材料，加入6mL pH 7.8磷酸缓冲液（不加聚乙烯吡咯烷酮）提取，离心后冷冻保存，以顺序完成实验。