动物基因组DNA的分离与核酸浓度的测定
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动物基因组DNA的分离与 核酸浓度的测定
实验方法
先将小鼠肝脏进行预处理：断颈法处死一只小鼠， 采集肝脏组织，用生理盐水清洗血污。
取一只小鼠的肝脏（约2g），加入20 mL匀浆缓冲 液（STE buffer），用电动组织匀浆器匀浆至无明 显组织块存在（最好冰浴操作）。
将组织细胞的匀浆液体转移至15 mL蓝盖离心管中， 4℃ 4000 r/min离心15 min，弃上清，留沉淀。
小心吸出EP管中的上层液体，即为含DNA的水相，注意 不要吸中间界面上一层厚的白色物质（蛋白质沉淀）。然 后加入等体积氯仿／异戊醇，12000 r/min，4℃离心10 min。(如果界面或水相中含蛋白质沉淀较多，可重复操作 6～7)
小心吸出上层含DNA的水相，加入1/10体积NaAc，充分 混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，置－ 20℃冰箱约2 h。
12000 r/min，4℃离心10 min，弃上清液，得到的白色 沉淀。加入1 mL 70％冷乙醇洗涤，继续离心，获得沉淀， 室温干燥。加入50 L TE缓冲液溶解，即可得到基因组 DNA。－20℃冰箱保存。
如果要对提取的DNA进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝 胶。方法是取1 l溶解的DNA样品，在1％的琼脂糖凝胶 中进行电泳，用溴化乙锭（或Goldenview）染色观察结 果。
每组取1 μL 、2 μL DNA样品，加0.4 μL电泳上样缓冲液 （含溴酚蓝），少量的水（10 ul），混匀后加样于琼脂 糖凝胶孔内。
电泳（小胶100-120V，大胶150-180V）：使DNA移入琼 脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移至中间即可停止电泳。
用短波紫外线（254 nm）进行拍照，比较样品DNA与 DNA标准品（marker）的荧光强度（一般最亮的条带为 750bp，上样5 ul约100 ng），并计算出待测样品中DNA 的浓度。
沉淀中加入6 mL消化缓冲液（含蛋白酶K），轻轻 反转混匀，50～55 ℃温育1 h。
加入RNA酶（10mg/mL）至终浓度200 g/mL， 37℃水浴0.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ h。
每小组取1.5 ml EP管，加入上述消化细胞液600ul ，加 入等体积酚／氯仿／异戊醇，缓慢颠倒离心管使两相均匀 混合形成乳浊液，1200 r/min，4℃离心10 min。
如果DNA已经降解，DNA的带就会拖尾巴，或出现弥散 性分布，而不能形成清晰、紧凑的带纹，这样的DNA样 品不能用于进一步研究。
实验方法
先将小鼠肝脏进行预处理：断颈法处死一只小鼠， 采集肝脏组织，用生理盐水清洗血污。
取一只小鼠的肝脏（约2g），加入20 mL匀浆缓冲 液（STE buffer），用电动组织匀浆器匀浆至无明 显组织块存在（最好冰浴操作）。
将组织细胞的匀浆液体转移至15 mL蓝盖离心管中， 4℃ 4000 r/min离心15 min，弃上清，留沉淀。
小心吸出EP管中的上层液体，即为含DNA的水相，注意 不要吸中间界面上一层厚的白色物质（蛋白质沉淀）。然 后加入等体积氯仿／异戊醇，12000 r/min，4℃离心10 min。(如果界面或水相中含蛋白质沉淀较多，可重复操作 6～7)
小心吸出上层含DNA的水相，加入1/10体积NaAc，充分 混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，置－ 20℃冰箱约2 h。
12000 r/min，4℃离心10 min，弃上清液，得到的白色 沉淀。加入1 mL 70％冷乙醇洗涤，继续离心，获得沉淀， 室温干燥。加入50 L TE缓冲液溶解，即可得到基因组 DNA。－20℃冰箱保存。
如果要对提取的DNA进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝 胶。方法是取1 l溶解的DNA样品，在1％的琼脂糖凝胶 中进行电泳，用溴化乙锭（或Goldenview）染色观察结 果。
每组取1 μL 、2 μL DNA样品，加0.4 μL电泳上样缓冲液 （含溴酚蓝），少量的水（10 ul），混匀后加样于琼脂 糖凝胶孔内。
电泳（小胶100-120V，大胶150-180V）：使DNA移入琼 脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移至中间即可停止电泳。
用短波紫外线（254 nm）进行拍照，比较样品DNA与 DNA标准品（marker）的荧光强度（一般最亮的条带为 750bp，上样5 ul约100 ng），并计算出待测样品中DNA 的浓度。
沉淀中加入6 mL消化缓冲液（含蛋白酶K），轻轻 反转混匀，50～55 ℃温育1 h。
加入RNA酶（10mg/mL）至终浓度200 g/mL， 37℃水浴0.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ h。
每小组取1.5 ml EP管，加入上述消化细胞液600ul ，加 入等体积酚／氯仿／异戊醇，缓慢颠倒离心管使两相均匀 混合形成乳浊液，1200 r/min，4℃离心10 min。
如果DNA已经降解，DNA的带就会拖尾巴，或出现弥散 性分布，而不能形成清晰、紧凑的带纹，这样的DNA样 品不能用于进一步研究。