靶向HDGF-siRNA转染对小鼠结直肠癌肝转移的影响

靶向HDGF-siRNA转染对小鼠结直肠癌肝转移的影响
作者：杨荣娇廖剑敏
来源：《中国医学创新》2022年第02期
【摘要】目的：探討肝癌衍生生长因子（HDGF）的小分子干扰RNA（siRNA）对BALB/c小鼠结直肠癌肝转移的影响。

方法：选择78只SPF级BALB/c雄性小鼠，应用盲肠造疝原位接种瘤块法建立小鼠结直肠癌肝转移模型。

将成功建模的小鼠随机分为3组，即HDGF-siRNA组、NS-siRNA组与生理盐水（NS）组。

根据分组情况，分别于肿瘤原位注射HDGF-siRNA、非特异性siRNA（NS-siRNA）及生理盐水，剂量均为0.15 ng/kg，连续治疗30 d。

分时间点记录各组小鼠体质量的变化。

治疗结束3 d后处死小鼠，肉眼及肝脏切片苏木素-伊红（HE）染色观察各组结直肠癌肝转移情况。

结果：治疗5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA组的体质量均明显高于NS-siRNA组与NS组，NS-siRNA组的体质量均明显高于NS组（P<0.05）。

HDGF-siRNA组的肝转移结节数明显少于NS-siRNA组及NS组，肝转移率明显低于NS-siRNA组及NS组（P<0.05）。

NS-siRNA组的肝转移结节数明显少于NS组（P<0.05），NS-siRNA组与NS组的肝转移率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

结论：HDGF-siRNA可靶向抑制HDGF，从而降低小鼠结直肠癌肝转移的发生，HDGF在结直肠癌肝转移中可能起了重要作用。

【关键词】肝癌衍生生长因子小分子干扰RNA 结直肠癌肝转移 HDGF-siRNA BALB/c
小鼠
Effect of Targeting HDGF-siRNA Transfection on Liver Metastasis of Colorectal Cancer in Mice/YANG Rongjiao， LIAO Jianmin. //Medical Innovation of China， 2022， 19（02）： 0-031
[Abstract] Objective： To investigate the effect of small interfering RNA （siRNA） of hepatoma-derived growth factor （HDGF） on liver metastasis of colorectal carcinoma in BALB/c mice. Method： A total of 78 SPF BALB/c
male mice were used to establish the model of hepatic metastasis of colorectal cancer. The tumor-bearing mice were randomly divided into three groups， namely HDGF-siRNA group， NS-siRNA group and normal saline （NS） group. According to the grouping， HDGF-siRNA， normal saline nonspecific siRNA （NS-siRNA） and normal saline were injected into the tumor in situ at the dose of 0.15 ng/kg for 30 d. The changes of body weight of each group were recorded at time points. The mice were killed 3 d after treatment. The liver metastasis of colorectal cancer in each group was observed by naked eye and hematoxylin-eosin （HE） staining. Result： After treatment for 5，10， 15， 20， 25 and 30 d， the body weights of HDGF-siRNA group were significantly higher than those of NS-siRNA group and NS group （P<0.05）. The number of liver metastasis nodules in HDGF-siRNA group was significantly less than those in NS-siRNA group and NS group， and the liver metastasis rate was significantly less than those in NS-siRNA group and NS group （P<0.05）. The number of hepatic metastatic nodules in NS-siRNA group was significantly less than that in NS group （P<0.05）， there was no significant difference in liver metastasis rate between NS-siRNA group and NS group （P>0.05）. Conclusion： HDGF-siRNA can inhibit HDGF and reduce the occurrence of liver metastasis of colorectal cancer in mice， HDGF-siRNA may play an important role in liver metastasis of colorectal cancer.
[Key words] Liver cancer derived growth factor Small interfering RNA Liver metastasis of colorectal cancer HDGF-siRNA BALB/c mice
First-author’s address：The People’s Hospital of Qingyuan City， Guangdong Province，Qingyuan 511518， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.02.007
随着我国人们膳食结构改变及老龄化形势日益加重，结直肠癌的发病率和死亡率越来越高[1]。

同时，结直肠癌患者较易发生肝脏侵袭，而肝转移也是结直肠癌患者的主要死亡原因[2-3]。

虽然，近年来结直肠癌肝转移临床治疗技术均有较大提升，如手术、放化疗等，但临床效果不太理想，患者预后差[4]。

RNA干扰技术是快速高效关闭基因的分子生物学方法，可使目的基因表达被有效阻断。

研究显示，肝癌衍生生长因子（HDGF）可通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）产生，促进血管生成和肿瘤生长[5-6]，与胃癌、胆囊癌、胰腺癌、食管癌、肾癌、肺癌等多种恶性肿瘤的生长进展相关[7-12]。

本研究拟以HDGF为靶点，在体内结直腸癌肝转移动物模型基础上，探讨靶向HDGF-siRNA转染对小鼠结直肠癌肝转移的影响。

1 材料与方法
1.1 基因序列的设计通过进入National center for biotechnology数据库中，找到HDGF cDNA的全长碱基序列，利用广州道森生物科技有限公司的“siRNA Target Finder and Design Tools”软件设计HDGF-siRNA序列，最终设计出3条针对HDGF-siRNA正反义链序列：（1）siRNA1，CAACAAAUACCAAGUCUUU dTdT，dTdT GUUGUUUAUGGUUCAGAAA;（2）siRNA2，CAAGGAGAAGAACGAGAAA dTdT，dTdT GUUCCUCUUCUUGCUCUUU;（3）siRNA3，CUACCAAGGAAGAUGCUGA dTdT，dTdT GAUGGUUCCUUCUACGACU）。

阴性对照siRNA（NS-siRNA）自行设计，以上设计好后均交由广州道森生物科技有限公司合成。

1.2 小鼠结直肠癌肝转移模型的建
1.2.1 实验动物选择78只SPF级BALB/c小鼠[购自广东省医学实验动物中心，生产许可编号：SXCK（粤）2018-0002]，周龄为6～8周，均为雄性，体质量为17～22 g。

饲养条件：自然采光，温度和为湿度分别调节为18～25 ℃和60%～70%，喂养给予普通饲料和自由饮水。

1.2.2 CT26细胞悬液的制备将小鼠结肠腺癌细胞（CT26细胞）置于RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清）中，培养条件为5%CO2细胞培养箱和37 ℃，应用0.25%胰蛋白酶消化法对指数生长期的细胞进行处理，并经机械吹打，制成细胞悬液，并离心5 min（转速1 000
r/min），弃去上清液，加入生理盐水配制成浓度为1×106/mL，应用台盼蓝染色法检测细胞活力>95%。

1.2.3 实体瘤的获得随机抓取2只小鼠，于项背部皮下注射0.4 mL的CT26细胞悬液，10 d后可见有肿块（直径约1 cm）形成，对其进行组织取样，经病理检查确诊为癌组织。

1.2.4 盲肠造疝原位接种瘤块术对小鼠进行全身麻醉，使用50 mg/mL的舒泰50进行肌肉注射，剂量为0.01 mL/10 g。

然后取仰卧位，固定其四肢，对腹部术野使用75%酒精进行消毒，对左下腹皮肤做直径约2 cm的纵向切口，稍微游离切口右侧皮肤及皮下组织，进腹，将盲肠拖出体外，并刮破其拖出段的中央位置的浆膜，再将瘤块（直径约2 mm）置入浆膜刮破处，采取荷包缝合包埋术，再将盲肠拖出段埋回腹腔，并进行腹壁缝合[13-14]。

术后小鼠在SPF条件下饲养。

1.3 动物模型分组与治疗成功建模后，随机将78只小鼠分为3组，各26只，分别为HDGF-siRNA组、NS-siRNA组与NS组，于肿瘤原位分别注射靶向HDGF-siRNA、非特异性siRNA（NS-siRNA）及生理盐水（NS），剂量均为0.15 ng/kg，每周2次，连续治疗30 d。

治疗结束3 d后，对小鼠进行CO2吸入法处死。

1.4 观察指标成功建模后，分别于治疗前及治疗1、5、10、15、20、25、30 d后记录小鼠的体质量。

对小鼠进行剖腹手术，摘取肝脏，并称重标记大小。

（1）光镜观察：使用10%甲醛对肝脏组织进行固定，石蜡包埋，切片（4 μm），行苏木素-伊红（HE）染色，并行光镜下观察。

（2）显微镜观察：取相距为2 mm的肝脏冠状切面组织共5个，以最大冠状切面为中心，并行显微镜下观察，统计肝转移结节数。

肝转移结节数=肉眼下计数+显微镜下计数。

若同一肝转移结节在不同切面出现应视为1个肝转移结节。

以肉眼及显微镜下未见转移结节的视为无肝转移发生，反之出现肝转移，比较各组转移率。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件，计量数据以（x±s）表示，三组间比较行F检验，计数数据以率（%）表示，比较行字2检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组肝转移模型小鼠体质量变化比较治疗前和治疗1 d后，三组体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA组的体质量均明显高于NS-siRNA组与NS组，NS-siRNA组的体质量均明显高于NS组（P<0.05）。

见表1。

[Key words] Liver cancer derived growth factor Small interfering RNA Liver metastasis of colorectal cancer HDGF-siRNA BALB/c mice
First-author’s address：The People’s Hospital of Qingyuan City， Guangdong Province，Qingyuan 511518， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.02.007
随着我国人们膳食结构改变及老龄化形势日益加重，结直肠癌的发病率和死亡率越来越高[1]。

同时，结直肠癌患者较易发生肝脏侵袭，而肝转移也是结直肠癌患者的主要死亡原因[2-3]。

虽然，近年来结直肠癌肝转移临床治疗技术均有较大提升，如手术、放化疗等，但临床效果不太理想，患者预后差[4]。

RNA干扰技术是快速高效关闭基因的分子生物学方法，可使目的基因表达被有效阻断。

研究显示，肝癌衍生生长因子（HDGF）可通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）产生，促进血管生成和肿瘤生长[5-6]，与胃癌、胆囊癌、胰腺癌、食管癌、肾癌、肺癌等多种恶性肿瘤的生长进展相关[7-12]。

本研究拟以HDGF为靶点，在体内结直肠癌肝转移动物模型基础上，探讨靶向HDGF-siRNA转染对小鼠结直肠癌肝转移的影响。

1 材料与方法
1.1 基因序列的设计通过进入National center for biotechnology数据库中，找到HDGF cDNA的全长碱基序列，利用广州道森生物科技有限公司的“siRNA Target Finder and Design Tools”软件设计HDGF-siRNA序列，最终设计出3条针对HDGF-siRNA正反义链序列：（1）siRNA1，CAACAAAUACCAAGUCUUU dTdT，dTdT GUUGUUUAUGGUUCAGAAA;（2）
siRNA2，CAAGGAGAAGAACGAGAAA dTdT，dTdT GUUCCUCUUCUUGCUCUUU;（3）siRNA3，CUACCAAGGAAGAUGCUGA dTdT，dTdT GAUGGUUCCUUCUACGACU）。

阴性对照siRNA（NS-siRNA）自行设计，以上设计好后均交由广州道森生物科技有限公司合成。

1.2 小鼠结直肠癌肝转移模型的建
1.2.1 实验动物选择78只SPF级BALB/c小鼠[购自广东省医学实验动物中心，生产许可编号：SXCK（粤）2018-0002]，周龄为6～8周，均为雄性，体质量为17～22 g。

饲养条件：自然采光，温度和为湿度分别调节为18～25 ℃和60%～70%，喂养给予普通饲料和自由饮水。

1.2.2 CT26细胞悬液的制备将小鼠结肠腺癌细胞（CT26细胞）置于RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清）中，培养条件为5%CO2细胞培养箱和37 ℃，应用0.25%胰蛋白酶消化法对指数生长期的细胞进行处理，并经机械吹打，制成细胞悬液，并离心5 min（转速1 000
r/min），弃去上清液，加入生理盐水配制成浓度为1×106/mL，应用台盼蓝染色法检测细胞活力>95%。

1.2.3 实体瘤的获得随机抓取2只小鼠，于项背部皮下注射0.4 mL的CT26细胞悬液，10 d后可见有肿块（直径约1 cm）形成，对其进行组织取样，经病理检查确诊为癌组织。

1.2.4 盲肠造疝原位接种瘤块术对小鼠进行全身麻醉，使用50 mg/mL的舒泰50进行肌肉注射，剂量为0.01 mL/10 g。

然后取仰卧位，固定其四肢，对腹部术野使用75%酒精进行消毒，对左下腹皮肤做直径约2 cm的纵向切口，稍微游离切口右侧皮肤及皮下组织，进腹，将盲肠拖出体外，并刮破其拖出段的中央位置的浆膜，再将瘤块（直径约2 mm）置入浆膜刮破处，采取荷包缝合包埋术，再将盲肠拖出段埋回腹腔，并进行腹壁缝合[13-14]。

术后小鼠在SPF条件下饲养。

1.3 动物模型分组与治疗成功建模后，随机将78只小鼠分为3组，各26只，分别为HDGF-siRNA组、NS-siRNA组与NS组，于肿瘤原位分别注射靶向HDGF-siRNA、非特异性siRNA（NS-siRNA）及生理盐水（NS），剂量均为0.15 ng/kg，每周2次，连续治疗30 d。

治疗结束3 d后，对小鼠进行CO2吸入法处死。

1.4 观察指标成功建模后，分别于治疗前及治疗1、5、10、15、20、25、30 d后记录小鼠的体质量。

对小鼠进行剖腹手术，摘取肝脏，并称重标记大小。

（1）光镜观察：使用10%甲醛对肝脏组织进行固定，石蜡包埋，切片（4 μm），行苏木素-伊红（HE）染色，并行光镜下观察。

（2）显微镜观察：取相距为2 mm的肝脏冠状切面组织共5个，以最大冠状切面为中心，并行显微镜下观察，统计肝转移结节数。

肝转移结节数=肉眼下计数+显微镜下计数。

若同
一肝转移结节在不同切面出现应视为1个肝转移结节。

以肉眼及显微镜下未见转移结节的视为无肝转移发生，反之出现肝转移，比较各组转移率。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件，计量数据以（x±s）表示，三组间比较行F检验，计数数据以率（%）表示，比较行字2检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组肝转移模型小鼠体质量变化比较治疗前和治疗1 d后，三组体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA组的体质量均明显高于NS-siRNA组与NS组，NS-siRNA组的体质量均明顯高于NS组（P<0.05）。

见表1。

[Key words] Liver cancer derived growth factor Small interfering RNA Liver metastasis of colorectal cancer HDGF-siRNA BALB/c mice
First-author’s address：The People’s Hospital of Qingyuan City， Guangdong Province，Qingyuan 511518， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.02.007
随着我国人们膳食结构改变及老龄化形势日益加重，结直肠癌的发病率和死亡率越来越高[1]。

同时，结直肠癌患者较易发生肝脏侵袭，而肝转移也是结直肠癌患者的主要死亡原因[2-3]。

虽然，近年来结直肠癌肝转移临床治疗技术均有较大提升，如手术、放化疗等，但临床效果不太理想，患者预后差[4]。

RNA干扰技术是快速高效关闭基因的分子生物学方法，可使目的基因表达被有效阻断。

研究显示，肝癌衍生生长因子（HDGF）可通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）产生，促进血管生成和肿瘤生长[5-6]，与胃癌、胆囊癌、胰腺癌、食管癌、肾癌、肺癌等多种恶性肿瘤的生长进展相关[7-12]。

本研究拟以HDGF为靶点，在体内结直肠癌肝转移动物模型基础上，探讨靶向HDGF-siRNA转染对小鼠结直肠癌肝转移的影响。

1 材料与方法
1.1 基因序列的设计通过进入National center for biotechnology数据库中，找到HDGF cDNA的全长碱基序列，利用广州道森生物科技有限公司的“siRNA Target Finder and Design Tools”软件设计HDGF-siRNA序列，最终设计出3条针对HDGF-siRNA正反义链序列：（1）siRNA1，CAACAAAUACCAAGUCUUU dTdT，dTdT GUUGUUUAUGGUUCAGAAA;（2）siRNA2，CAAGGAGAAGAACGAGAAA dTdT，dTdT GUUCCUCUUCUUGCUCUUU;（3）siRNA3，CUACCAAGGAAGAUGCUGA dTdT，dTdT GAUGGUUCCUUCUACGACU）。

阴性对照siRNA（NS-siRNA）自行设计，以上设计好后均交由广州道森生物科技有限公司合成。

1.2 小鼠结直肠癌肝转移模型的建
1.2.1 实验动物选择78只SPF级BALB/c小鼠[购自广东省医学实验动物中心，生产许可编号：SXCK（粤）2018-0002]，周龄为6～8周，均为雄性，体质量为17～22 g。

饲养条件：自然采光，温度和为湿度分别调节为18～25 ℃和60%～70%，喂养给予普通饲料和自由饮水。

1.2.2 CT26细胞悬液的制备将小鼠结肠腺癌细胞（CT26细胞）置于RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清）中，培养条件为5%CO2细胞培养箱和37 ℃，应用0.25%胰蛋白酶消化法对指数生长期的细胞进行处理，并经机械吹打，制成细胞悬液，并离心5 min（转速1 000
r/min），弃去上清液，加入生理盐水配制成浓度为1×106/mL，应用台盼蓝染色法检测细胞活力>95%。

1.2.3 实体瘤的获得随机抓取2只小鼠，于项背部皮下注射0.4 mL的CT26细胞悬液，10 d后可见有肿块（直径约1 cm）形成，对其进行组织取样，经病理检查确诊为癌组织。

1.2.4 盲肠造疝原位接种瘤块术对小鼠进行全身麻醉，使用50 mg/mL的舒泰50进行肌肉注射，剂量为0.01 mL/10 g。

然后取仰卧位，固定其四肢，对腹部术野使用75%酒精进行消毒，对左下腹皮肤做直径约2 cm的纵向切口，稍微游离切口右侧皮肤及皮下组织，进腹，将盲肠拖出体外，并刮破其拖出段的中央位置的浆膜，再将瘤块（直径约2 mm）置入浆膜刮破处，采取荷包缝合包埋术，再将盲肠拖出段埋回腹腔，并进行腹壁缝合[13-14]。

术后小鼠在SPF条件下饲养。

1.3 动物模型分组与治疗成功建模后，随机将78只小鼠分为3组，各26只，分别为HDGF-siRNA组、NS-siRNA组与NS组，于肿瘤原位分別注射靶向HDGF-siRNA、非特异性siRNA（NS-siRNA）及生理盐水（NS），剂量均为0.15 ng/kg，每周2次，连续治疗30 d。

治疗结束3 d后，对小鼠进行CO2吸入法处死。

1.4 观察指标成功建模后，分别于治疗前及治疗1、5、10、15、20、25、30 d后记录小鼠的体质量。

对小鼠进行剖腹手术，摘取肝脏，并称重标记大小。

（1）光镜观察：使用10%甲醛对肝脏组织进行固定，石蜡包埋，切片（4 μm），行苏木素-伊红（HE）染色，并行光镜下观察。

（2）显微镜观察：取相距为2 mm的肝脏冠状切面组织共5个，以最大冠状切面为中心，并行显微镜下观察，统计肝转移结节数。

肝转移结节数=肉眼下计数+显微镜下计数。

若同一肝转移结节在不同切面出现应视为1个肝转移结节。

以肉眼及显微镜下未见转移结节的视为无肝转移发生，反之出现肝转移，比较各组转移率。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件，计量数据以（x±s）表示，三组间比较行F检验，计数数据以率（%）表示，比较行字2检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组肝转移模型小鼠体质量变化比较治疗前和治疗1 d后，三组体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA组的体质量均明显高于NS-siRNA组与NS组，NS-siRNA组的体质量均明显高于NS组（P<0.05）。

见表1。