土壤PLFA的步骤
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0甲酯到200ml甲醇中81m冰醋酸03ml样品数29ml冰醋酸50ml水可用时间较长可能操作台已有9氯仿156ml样品数10甲醇1575ml样品数试剂11正已烷06ml样品数1试剂瓶78个每批2小烧杯810个批3量筒100ml的1个50ml的24个4移液管10ml的3个5ml的6个2ml的5个1ml的5个5长滴管5个样品数购买650ml的带盖试管1个样品数到管理员处领用710ml的带改试管3个样品数到管理员处领用实验所用的所有玻璃仪器需先超声波洗涤10分钟后在马福炉400烧烤30分钟以上
取液
4.5ml/ 样品数
氯仿:甲醇:柠檬酸缓冲 液=1:2:0.8(体积比)
3 正已烷氯仿混合液
4ml/样品数
正已烷:氯仿=4:1(体积 比)
4 甲醇甲苯混合液
1ml/样品数
甲醇:甲苯=1:1(体积比)
试5
丙酮
剂
0.2mol/L 氢氧化钾
6
甲醇溶液
内标 14:0 脂肪酸 7
甲酯
8
1M 冰醋酸
5ml/样品数 1ml/样品数 0.2ml/ 样品数 0.3ml/ 样品数
之后，按顺序加入以下试剂：1.5ml 柠檬酸缓冲液（可用枪），1.9ml 氯仿（移液管，凡 是转移有机溶剂，均需用移液管或滴管等玻璃仪器，以下同），3.75ml 甲醇，2mlBligh-Dyer 土壤提取液。 3、旋涡振荡 5 分钟。 4、避光静置过夜（提取效率 95％）。
第三天： 1、吸取上清液于 30mlTeflon 离心管中，注意不要把土样移入，宁可少转一点。放入 0℃冰
的 2-4 个 10ml 的 3 个,5ml 的 6 个,2ml 的 5 个,1ml
的5个 5 个/样品数
50ml 的带盖试管
1 个/样品数
10ml 的带改试管
3 个/样品数
1 个/样品数（6、7、
8
Teflon 离心管 8 可洗涤后利用，为
每批的样品数）
橡皮胶头,洗耳球,
9
其他器材
角勺 ,试管架，旋涡
带盖试管。 8、 加 10ml 甲醇（如果用 10ml 的带盖试管，加 8ml 即可），洗磷脂于试管中。 9、 取出试管，并用氮气吹干收集物。 10、加入 200µl 内标（10：0 或 12：0 或 14：0 磷脂脂肪酸，不过用磷脂也许更好。） 11、氮气吹干，零度保存。
第六天： 1、 配制 0.2mol/L 氢氧化钾甲醇溶液：0.56gKOH 溶解于 50ml 甲醇中。 2、 加入 1ml 甲醇甲苯混合液于零度保存的试管中，溶解磷脂。 3、 加 1ml0.2mol/L 的氢氧化钾甲醇溶液。 4、 37±1℃水浴 15 分钟。 5、 加入 2ml 正已烷氯仿混合液。 6、 加入 0.3ml1M 的醋酸。 7、 加入 2ml 去离子水。 8、 旋涡振荡 30s，4000 转/分离心 10 分钟。 9、 转移上层有机相到 10ml 带盖试管中。 10、加 2ml 正已烷氯仿混合液于原试管中重新提取。 11、重复步骤 8。 12、转移上层有机相到同一试管中。 13、氮气吹干
箱保存。 2、加入 2.5mlBligh-Dyer 提取液于带盖试管中，进行再次提取。 3、旋涡振荡 5 分钟。 4、避光静置过夜（提取效率 98％）。
第四天： 1、将上清液吸入同一 30mlTeflon 管中。 2、按以下顺序加入 Teflon 离心管中：3.1ml 柠檬酸，3.1ml 氯仿。
3、旋涡振荡 30s，后 1500 转/min 离心 10 分钟。 4、用吸管把下层液转移到 10ml 带盖试管中。（在吸管从上层液进入下层液的过程中要确保
下，烘烤 30 分钟以上。完毕，打开门，使炉中器皿温度降低，方可取出，否则器皿容易 破裂。
第二天： 1、按实验所需土样，放入塑料瓶中，并用滤纸封盖。真空冷冻干燥 10 个小时以上，早晨开
始到晚上结束。出于安全考虑，冷冻干燥仪器不允许夜间运行。 2、称取 3.0000g 冷冻干燥土样（有机质土<0.5g，矿质土 2-4g），放入 50ml 的带盖试管中。
0.56 氢氧化钾/50ml 甲醇
当天配制
5．7mg14:0 甲酯到 200ml 甲醇中
2.9ml 冰醋酸/50ml 水
可用时间较长,可 能操作台已有
9
氯仿
15.6ml/样品数
10 11 1 2 3
4
5 器
6 材
7
甲醇 正已烷 试剂瓶 小烧杯
量筒
移பைடு நூலகம்管
长滴管
15.75ml/样品数
0.6ml/ 样品数 7-8 个/每批 8-10 个/批 100ml 的 1 个,50ml
没有上层液进入吸管中） 5、在通风橱中，用恒温氮吹仪吹干，注意对号入座，可防止交叉污染。温度设为 25-30℃，
不能超过 40℃。针头最好每批在马福炉中烘烤一次。 6、吹干之后，加入 1ml 甲醇，手振荡，然后再吹干。 7、重复 6 步骤一次。 8、盖好盖子，放入 0℃冰箱保存。
第五天： 1、 准备好 SPE 柱（自己购买或者到管理员处转帐买）。把柱放在防交叉污染 SPE 柱萃取装
置上。 2、 氯仿 5ml 洗柱。 3、 上样：用 3ml 氯仿溶解样品（不需要太精确，可以直接用吸管加氯仿），旋涡振荡充分
溶解，转移到 SPE 柱中。重复该步骤一次。 4、 加 5ml 氯仿，洗中性脂。 5、 加 5ml 丙酮（分两次，即一次加 2.5ml），洗醣脂。 6、 倒掉 SPE 萃取装置中的废液。 7、 在 SPE 萃取装置内放置试管架及试管，注意样品转移的对号入座。试管可以用 10ml 的
二、流程图
真空冷 冻干燥 土壤
脂类的提 取
过 SPE 柱 分离磷脂 PLFA
GC 测定
甲酯化成 FAME
三、操作步骤 本实验周期较长，需要五天左右 ，操作时慎重。以下按天数进行说明，自己可以根据实
际情况适当调整时间安排。 第一天：
1、按上表配制试剂，准备实验材料及器皿。 2、实验所需玻璃器皿，先超声洗涤 10 分钟，然后用蒸馏水冲洗，放入马福炉中，在 400℃
振荡仪,pH 计等
购买 到管理员处领用 到管理员处领用
到管理员处领用
实验所用的所有 玻璃仪器,需先超 声波洗涤 10 分钟, 后在马福炉 400℃ 烧烤 30 分钟以上. 烧烤时,切记不能 有塑料盖等燃烧 的物品,器皿上的
标签纸应撕下
不能烧烤,先超声 波洗涤 10 分钟,再 用甲醇润洗,最后
蒸馏水洗,烘干
GC 测定： 用 0.15ml 正已烷溶解 FAME（不需要太精确，可以直接用吸管加），并转移到 GC 内插
管中，重复三次，前两次可氮气吹干，最后一次氮气浓缩到 100µl 左右，交给 GC 测定操作 员上机测定。
一、试剂及器材，如下表：
序 名称
号
0.15mol/L 柠檬酸 1
缓冲液
土壤微生物 PLFA 的检测 (biogede@)
用量
配制方法
5.1ml/样品数(包含 平行和对照,以下 同)
按如下比例配:31.52g 柠 檬酸溶于 1L 去离子水
注
建议比理论所需 的要多一点,并为
50 的倍数
Bligh-Dyer 土壤提 2
取液
4.5ml/ 样品数
氯仿:甲醇:柠檬酸缓冲 液=1:2:0.8(体积比)
3 正已烷氯仿混合液
4ml/样品数
正已烷:氯仿=4:1(体积 比)
4 甲醇甲苯混合液
1ml/样品数
甲醇:甲苯=1:1(体积比)
试5
丙酮
剂
0.2mol/L 氢氧化钾
6
甲醇溶液
内标 14:0 脂肪酸 7
甲酯
8
1M 冰醋酸
5ml/样品数 1ml/样品数 0.2ml/ 样品数 0.3ml/ 样品数
之后，按顺序加入以下试剂：1.5ml 柠檬酸缓冲液（可用枪），1.9ml 氯仿（移液管，凡 是转移有机溶剂，均需用移液管或滴管等玻璃仪器，以下同），3.75ml 甲醇，2mlBligh-Dyer 土壤提取液。 3、旋涡振荡 5 分钟。 4、避光静置过夜（提取效率 95％）。
第三天： 1、吸取上清液于 30mlTeflon 离心管中，注意不要把土样移入，宁可少转一点。放入 0℃冰
的 2-4 个 10ml 的 3 个,5ml 的 6 个,2ml 的 5 个,1ml
的5个 5 个/样品数
50ml 的带盖试管
1 个/样品数
10ml 的带改试管
3 个/样品数
1 个/样品数（6、7、
8
Teflon 离心管 8 可洗涤后利用，为
每批的样品数）
橡皮胶头,洗耳球,
9
其他器材
角勺 ,试管架，旋涡
带盖试管。 8、 加 10ml 甲醇（如果用 10ml 的带盖试管，加 8ml 即可），洗磷脂于试管中。 9、 取出试管，并用氮气吹干收集物。 10、加入 200µl 内标（10：0 或 12：0 或 14：0 磷脂脂肪酸，不过用磷脂也许更好。） 11、氮气吹干，零度保存。
第六天： 1、 配制 0.2mol/L 氢氧化钾甲醇溶液：0.56gKOH 溶解于 50ml 甲醇中。 2、 加入 1ml 甲醇甲苯混合液于零度保存的试管中，溶解磷脂。 3、 加 1ml0.2mol/L 的氢氧化钾甲醇溶液。 4、 37±1℃水浴 15 分钟。 5、 加入 2ml 正已烷氯仿混合液。 6、 加入 0.3ml1M 的醋酸。 7、 加入 2ml 去离子水。 8、 旋涡振荡 30s，4000 转/分离心 10 分钟。 9、 转移上层有机相到 10ml 带盖试管中。 10、加 2ml 正已烷氯仿混合液于原试管中重新提取。 11、重复步骤 8。 12、转移上层有机相到同一试管中。 13、氮气吹干
箱保存。 2、加入 2.5mlBligh-Dyer 提取液于带盖试管中，进行再次提取。 3、旋涡振荡 5 分钟。 4、避光静置过夜（提取效率 98％）。
第四天： 1、将上清液吸入同一 30mlTeflon 管中。 2、按以下顺序加入 Teflon 离心管中：3.1ml 柠檬酸，3.1ml 氯仿。
3、旋涡振荡 30s，后 1500 转/min 离心 10 分钟。 4、用吸管把下层液转移到 10ml 带盖试管中。（在吸管从上层液进入下层液的过程中要确保
下，烘烤 30 分钟以上。完毕，打开门，使炉中器皿温度降低，方可取出，否则器皿容易 破裂。
第二天： 1、按实验所需土样，放入塑料瓶中，并用滤纸封盖。真空冷冻干燥 10 个小时以上，早晨开
始到晚上结束。出于安全考虑，冷冻干燥仪器不允许夜间运行。 2、称取 3.0000g 冷冻干燥土样（有机质土<0.5g，矿质土 2-4g），放入 50ml 的带盖试管中。
0.56 氢氧化钾/50ml 甲醇
当天配制
5．7mg14:0 甲酯到 200ml 甲醇中
2.9ml 冰醋酸/50ml 水
可用时间较长,可 能操作台已有
9
氯仿
15.6ml/样品数
10 11 1 2 3
4
5 器
6 材
7
甲醇 正已烷 试剂瓶 小烧杯
量筒
移பைடு நூலகம்管
长滴管
15.75ml/样品数
0.6ml/ 样品数 7-8 个/每批 8-10 个/批 100ml 的 1 个,50ml
没有上层液进入吸管中） 5、在通风橱中，用恒温氮吹仪吹干，注意对号入座，可防止交叉污染。温度设为 25-30℃，
不能超过 40℃。针头最好每批在马福炉中烘烤一次。 6、吹干之后，加入 1ml 甲醇，手振荡，然后再吹干。 7、重复 6 步骤一次。 8、盖好盖子，放入 0℃冰箱保存。
第五天： 1、 准备好 SPE 柱（自己购买或者到管理员处转帐买）。把柱放在防交叉污染 SPE 柱萃取装
置上。 2、 氯仿 5ml 洗柱。 3、 上样：用 3ml 氯仿溶解样品（不需要太精确，可以直接用吸管加氯仿），旋涡振荡充分
溶解，转移到 SPE 柱中。重复该步骤一次。 4、 加 5ml 氯仿，洗中性脂。 5、 加 5ml 丙酮（分两次，即一次加 2.5ml），洗醣脂。 6、 倒掉 SPE 萃取装置中的废液。 7、 在 SPE 萃取装置内放置试管架及试管，注意样品转移的对号入座。试管可以用 10ml 的
二、流程图
真空冷 冻干燥 土壤
脂类的提 取
过 SPE 柱 分离磷脂 PLFA
GC 测定
甲酯化成 FAME
三、操作步骤 本实验周期较长，需要五天左右 ，操作时慎重。以下按天数进行说明，自己可以根据实
际情况适当调整时间安排。 第一天：
1、按上表配制试剂，准备实验材料及器皿。 2、实验所需玻璃器皿，先超声洗涤 10 分钟，然后用蒸馏水冲洗，放入马福炉中，在 400℃
振荡仪,pH 计等
购买 到管理员处领用 到管理员处领用
到管理员处领用
实验所用的所有 玻璃仪器,需先超 声波洗涤 10 分钟, 后在马福炉 400℃ 烧烤 30 分钟以上. 烧烤时,切记不能 有塑料盖等燃烧 的物品,器皿上的
标签纸应撕下
不能烧烤,先超声 波洗涤 10 分钟,再 用甲醇润洗,最后
蒸馏水洗,烘干
GC 测定： 用 0.15ml 正已烷溶解 FAME（不需要太精确，可以直接用吸管加），并转移到 GC 内插
管中，重复三次，前两次可氮气吹干，最后一次氮气浓缩到 100µl 左右，交给 GC 测定操作 员上机测定。
一、试剂及器材，如下表：
序 名称
号
0.15mol/L 柠檬酸 1
缓冲液
土壤微生物 PLFA 的检测 (biogede@)
用量
配制方法
5.1ml/样品数(包含 平行和对照,以下 同)
按如下比例配:31.52g 柠 檬酸溶于 1L 去离子水
注
建议比理论所需 的要多一点,并为
50 的倍数
Bligh-Dyer 土壤提 2