抑制IL-1β表达对实验性小鼠溃疡性结肠炎的影响

抑制IL-1β表达对实验性小鼠溃疡性结肠炎的影响
张海峰;周国雄;曹维;张彬
【摘要】目的：建立小鼠结肠炎模型,予以抑制白介素-1β（IL-1β）的表达，分析
IL-1β与溃疡性结肠炎（UC）发生发展的相关性。

方法：建立与人UC相似的葡
聚糖硫酸钠（DSS）小鼠结肠炎动物模型，雌性BALB/c小鼠40只分为4组
（n=10）：正常对照组、DSS模型组、美沙拉嗪治疗组、地塞米松治疗组。

正常对照组小鼠自由饮用蒸馏水7天，其余3组小鼠饮用5%DSS溶液7天。

从给DSS第3天开始，美沙拉嗪治疗组胃管注入美沙拉嗪20mg·kg-1，每天3次，共5天；地塞米松治疗组给予地塞米松0.1mg·kg-1（0.2mL），腹腔注射，每天1次，共5天。

ELISA检测血清IL-1β浓度、RT-PCR、Western Blot检测结肠黏膜IL-1β表达变化，观察各组小鼠治疗前后疾病活动指数、结肠病理大体形态评分、组织学病理评分。

结果：血清及局部组织检测提示IL-1β在正常对照组中微弱表达，在DSS模型组中表达明显上调，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；地塞
米松组、美沙拉嗪组IL-1β表达低于DSS模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；地塞米松治疗组、美沙拉嗪治疗组小鼠结肠炎症状明显改善。

结论：IL-1β在小鼠UC中表达上调，参与疾病的发生发展，抑制其表达可治疗溃疡性结肠
炎。

%Objective:The study was designed to detect the expression of IL-1β
by establishing mice colitis model arising from dextran sodium sulphate (DSS) which was similar to ulcerative colitis (UC) of humans, and to give DXM or Mesalazine to interfere with the model so as to discuss whether there was a correlation between the treatment effect and the inhibition of the expression of IL-1β. Methods:A mice colitis model was set up:BALB/C female mice(n=40)were divided into 4 groups:the normal group(n=10), the
DSS model group(n=10), the Mesalazine treatment group(n=10), and the DXM treatment group(n=10). The normal group were given distilled water freely for 7 days, and all of them were put to death by luxation vertebrae on the 8th day. The others were given the same solution of 5% DSS to drink for 7 days, and were put to death in the same way on the 8th day. Among them, the DSS model group were given NS(0.2 mL) by intraperitoneal injection every day from the third day to the 7th day;the mes alazine treatment group were given Mesalazine of 20~30mg·kg-1·d-1 by injection into the Stomach tube;Dexamethasone treatment group were given dexamethasone of 0.1 mg·kg-1·d-1 (0.2 mL) in the same way. The obvious pathological changes in the colon tissue of all groups were taken to detect the expression of IL-1β by ways of RT-PCR and Western Blot. Results:IL-1β was expressed faintly in the normal mice group, and was up-regulated in the mice colitis model arising from DSS. The normal group had statistically significant difference from the DSS model group(P<0.05). The levels of IL-1βin the Mesalazine treatment group and Dexamethasone treatment group were low-er than in the DSS model group (P<0.05). Conclusions:The expression of IL-1β was up-regulated in the mice models of UC arising from DSS, and was closely related with the occurrence and development of UC. Therefore, inhibition of IL-1βexpression by TL might be a useful treatment method for UC.
【期刊名称】《交通医学》
【年(卷),期】2016(030)003
【总页数】5页(P209-213)
【关键词】溃疡性结肠炎;IL-1β;地塞米松;美沙拉嗪
【作者】张海峰;周国雄;曹维;张彬
【作者单位】南通大学附属医院 1感染性疾病科;消化科，江苏226001;消化科，
江苏226001;南通大学附属医院 1感染性疾病科
【正文语种】中文
【中图分类】R574.62
在溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）活动期许多趋化因子表达持续增高，
包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1、MCP-2、MCP-3、巨噬细胞炎症蛋白-1α、巨噬细胞炎症蛋白-3α、巨噬细胞炎症蛋白-1β、RAN TES、EOT、生长相
关癌基因2α、78氨基酸残基的上皮细胞来源的中性粒细胞活化剂（ENA278）、巨噬细胞炎症蛋白-2α（MIP-2α）等［1-10］。

IL-1β是一种能激活多种免疫和
炎症细胞的前炎性细胞因子，主要由单核细胞、肥大细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等分泌产生。

IL-1有2种形式，即IL-1α 和IL-1β，人体内IL-1的活性主要由IL-1β介导。

本研究选择与人溃疡性结肠炎相似的葡聚糖硫酸钠（DSS）所致的小鼠
结肠炎模型，分别予以地塞米松、美沙拉嗪治疗，检测血清及结肠中IL-1β的表达，分析治疗效应是否与抑制IL-1β的表达有关。

1.1 动物模型的建立雌性BALB/c小鼠，4～6周龄，体重20～24g，南通大学动物实验中心提供，小鼠在该中心动物房饲养2周，混合配方饲料，自
由饮用蒸馏水，恒温（22℃～24℃）衡湿（49%），建立12h明暗周期，保持环境通风及清洁卫生。

随机分为4组，每组10只：正常对照组，葡聚糖硫酸钠（DSS，美国MP Biomedicals公司）模型组，美沙拉嗪治疗组，地塞米松治疗
组。

正常对照组小鼠自由饮用蒸馏水7天，其余3组小鼠参照Stevceva等［11］方法，饮用5%DSS溶液7天。

从给DSS第3天开始，美沙拉嗪治疗组胃管注入
美沙拉嗪20mg/kg，每天3次，共5天；地塞米松治疗组给予地塞米松
0.1mg·kg-1（0.2mL），腹腔注射，每天1次，共5天。

第8天颈椎脱臼法处死各组小鼠，取小鼠结肠标本。

本实验已通过南通大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 疾病活动指数（DAI）评分从给予DSS起，每日观察小鼠精神、活动、饮食、体重变化、大便性状及便血情况，参照Murano［12］标准进行评分，计算疾病活动指数（DAI）。

见表1。

疾病活动指数（DAI）=（体重下降分
数+大便性状分数+便血分数）/3。

1.3 病理大体形态评分小鼠处死后，沿肠系膜连接处纵行剪开肠腔，
祛除大便，预冷生理盐水冲洗数次，在滤纸上吸干，将肠壁展开平铺、固定，肉眼观察炎症及溃疡发生情况，参照Ekstrom［13］标准进行评分，见表2。

切取病
灶肠段分3份：一份4%甲醛固定，送病理科，常规石腊包埋、切片、HE染色，
进行组织学观察；一份-80℃保存，留做逆转录RT-PCR；另一份提取蛋白，留做Western Blot检测。

1.4 组织学评分参照Boirivant［14］标准由两位病理科医师分别双
盲阅片，结果取均值。

评分标准：0分：正常；1分：极低白细胞浸润、＜
10%hpf；2分：少量白细胞浸润、10%～25%hpf；3分：中量白细胞浸润、25%～50%hpf、同时伴血管密集和肠壁增厚；4分：大量白细胞浸润、＞
50%hpf、血管高度密集、隐窝变形、扭曲。

1.5 ELISA检测血清IL-1β浓度ELISA检测各组小鼠血清IL-1β的浓度变化，按照说明书操作。

以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标
准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.6 RT-PCR检测结肠标本IL-1βmRNA表达从GeneBank查取基因序
列，引物设计和合成由上海生物工程公司完成。

IL-1β：5'-TGTGATGTTCCCATTAGAC-3'（上游）；5'-AATACCACTTGTTGGCTTA-3'（下游），大小约：142bp。

各反应管于荧光定量PCR仪进行扩增，95℃预变性2 min，95℃变性15 s，58℃退火25 s，72℃延伸35 s，循环45次，于每个循环在72℃采集荧光数值。

为了检测反应的特异性，循环结束后分析溶解曲线，分析
条件为95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。

为了消除样本、逆转录和PCR反应的差异，以目的基因mRNA和ACTIN mRNA含量的比值作为评价目的基因表达水平的指标。

1.7 Western-bloting检测IL-1β蛋白表达提取总蛋白，紫外分光光度
法测定总蛋白浓度，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），每孔蛋白上样量20μL；在垂直电泳槽中电泳后转膜至硝酸纤维素膜上，5%TBST
封闭4 h，加入稀释的IL-1β一抗（工作浓度1∶2 500）4℃孵育过夜；TBST洗
膜10 min×5次，加入稀释的二抗（工作浓度1∶5 000）孵育2 h，增强化学发
光（ECL）荧光试剂显影。

以β-actin为内参照，凝胶成像分析系统处理数据，以
IL-1β与内参照的灰度比值作为两者蛋白的相对表达量。

1.8 统计学处理以Windows Excel软件建立数据库，实验结果采用SPSS17.0统计软件进行分析。

计量资料用均数±标准差（±s）表示，差异性比较采用成组设计两样本均数比较t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 实验动物观察观察小鼠精神、体重、活动、毛色、饮食、体重变化、大便性状及便血情况。

正常组小鼠一般状况良好，大便正常，体重增加。

DSS 模型组小鼠给予DSS后，第2、3天开始出现饮食、活动减少、毛色灰暗、体重
减轻，稀烂便，第4、5天开始出现便中带血，体重明显下降，活动减少。

地塞米松治疗组、美沙拉嗪治疗组给予药物处理后，饮食及体重较DSS模型组有所增加，一般状态好转，活动增加，毛色好转，便血明显减轻，部分粪便形态逐渐恢复正常。

各组DAI指数变化见图1。

2.2 病理大体形态评分对照组小鼠结肠黏膜无充血水肿、糜烂及溃疡
形成，部分远端结肠黏膜轻度充血。

DSS模型组小鼠结肠充血水肿，远端结肠黏
膜重度充血水肿，多发糜烂及浅表溃疡形成。

地塞米松治疗组、美沙拉嗪治疗组结肠糜烂及溃疡明显减少，黏膜充血水肿较DSS模型组明显减轻。

按评分标准评分
结果见表3，正常组、美沙拉嗪治疗组、地塞米松治疗组与DSS模型组相比，差
异有统计学意义（P＜0.05）；美沙拉嗪治疗组与地塞米松治疗组相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 组织学观察及评分HE染色见正常组小鼠结肠黏膜上皮完整，未见糜烂及溃疡，固有层腺体形态正常、排列整齐；DSS模型组小鼠结肠黏膜上皮缺损，糜烂及溃疡形成明显，黏膜及黏膜下层可见大量的淋巴细胞和单核细胞浸润，偶见淋巴滤泡形成，部分固有层腺体破坏；美沙拉嗪治疗组、地塞米松治疗组结肠黏膜可见炎症细胞浸润，糜烂及溃疡程度较DSS模型组明显减轻。

各组组织学评分见
表4，正常组、美沙拉嗪治疗组、地塞米松治疗组与DSS模型组比较，差异有统
计学意义（P＜0.05）；美沙拉嗪治疗组与地塞米松治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 ELISA检测血清IL-1β浓度正常对照组小鼠血清IL-1β浓度为
40.32±9.02pg·mL-1，DSS模型组为102.26±12.10pg·mL-1，差异有统计学意
义（P＜0.05）；地塞米松治疗组为62.50±5.30pg·mL-1，美沙拉嗪治疗组为68.76±7.12pg·mL-1，与DSS模型组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；
地塞米松治疗组与美沙拉嗪治疗组比较，IL-1β表达差异无统计学意义（P＞
0.05）。

2.5 RT-PCR检测结肠标本IL-1βmRNA表达正常组IL-1β微弱表达（1.000±0.000），DSS模型组IL-1β表达上调（2.365±0.324），明显高于正常
组，差异有统计学意义（P＜0.05）；美沙拉嗪治疗组（1.652± 0.1520）、塞米
松治疗组（1.426±0.145）IL-1β表达上调，但明显低于DSS模型组，差异有统
计学意义（P＜0.05）；美沙拉嗪治疗组与地塞米松治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

见图2。

2.6 Western Blot检测结肠标本IL-1β蛋白表达正常对照组小鼠结肠标本IL-
1β微弱表达，DSS模型组IL-1β表达明显上调，与正常对照组比较差异有统计学
意义（P＜0.01）；地塞米松治疗组、美沙拉嗪治疗组IL-1β表达轻度上调，但明显低于DSS模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；地塞米松治疗组与美沙拉
嗪治疗组之间IL-1β表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

见图3。

IL-1β是一种能激活多种免疫和炎症细胞的前炎性细胞因子，主要由单核细胞、肥大细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等分泌产生。

IL-1有2种形式，即IL-1α和IL-1β，人体内IL-1的活性主要由IL-1β介导。

多项研究发现［15-23］，UC患者组血清IL-1β水平明显高于对照人群，受累黏膜IL-1β显著高于未受累黏膜，非活动期
UC患者IL-1βmRNA水平与正常人群相比无明显差异，UC患者治疗后IL-1β的
含量明显下降。

IL-1β在UC发生发展中的作用：（1）UC结肠黏膜固有层中活化的巨噬细胞可释放IL-1β，激活树突样细胞吞噬、消化外来抗原，释放抗原片段并呈递至T淋巴细胞而发生免疫反应；（2）IL-1β能增加由巨噬细胞所产生的细胞
因子如IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-18，使得炎症细胞向炎症部位聚集，导致肠道病变的发生，如结肠粘膜上皮的损伤、小血管炎、隐窝脓肿等；（3）IL-1β与IL-1受体的失衡是UC发生的重要环节；（4）IL-1β可以通过诱导释放
H2O2，影响Ca2+释放和NK-A的信号转导途径的开关，从而导致UC患者结肠平滑肌收缩功能的紊乱。

本研究发现，造模成功后DSS模型组IL-1β在血清及局部组织中的表达明显增高，提示IL-1β参与溃疡性结肠炎病变的发生发展，是重要的致病炎症因子。

地塞米松
治疗组、美沙拉嗪治疗组与模型组相比，血清及局部组织IL-1β表达均明显下调。

同时地塞米松治疗组、美沙拉嗪治疗组DAI评分、大体形态评分、病理积分明显
下降，小鼠健康状况明显好转、体重增加，提示治疗有效。

我们认为地塞米松、美沙拉嗪具有抑制IL-1β过表达的作用，从而治疗溃疡性结肠炎。

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