不同产地茯苓多糖抗氧化活性研究

不同产地茯苓多糖抗氧化活性研究
张培;胡怀娟;程苑;薛连海;侯智
【摘要】从5个不同产地的茯苓中提取茯苓多糖,采用苯酚硫酸法测其多糖含量,并以三种方式(清除羟基自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力及还原能力)对其体外抗氧化活性进行比较研究.结果表明,在所选五种不同产地的茯苓中,云南茯苓多糖的糖含量最高,为78.52％;三种体外抗氧化活性实验结果表明各产地的茯苓多糖均具有一定的抗氧化能力,且以云南茯苓多糖的抗氧化活性相对较强.
【期刊名称】《东莞理工学院学报》
【年(卷),期】2018(025)001
【总页数】5页(P63-67)
【关键词】茯苓多糖;抗氧化活性;·OH清除活性;O2-·清除活性;还原能力
【作者】张培;胡怀娟;程苑;薛连海;侯智
【作者单位】滁州学院材料与化学工程学院,安徽滁州 239000;滁州学院材料与化学工程学院,安徽滁州 239000;滁州学院材料与化学工程学院,安徽滁州 239000;滁州学院材料与化学工程学院,安徽滁州 239000;滁州市科学技术局,安徽滁州239000
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
茯苓为多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos ( Schw.) Wolf)的干燥菌核[1-2]，史载于
《神农本草经》，为我国传统中药[3]，以云南的“云苓”、安徽的“安苓” 和福建的“闽苓”最为著名[4]。

茯苓多糖为茯苓的主要有效成分之一，具有较强的体外抗氧化活性[5-6]，对清除
超氧阴离子自由基、清除DPPH 自由基、抑制羟基自由基的产生均具有一定作用[7]。

目前对茯苓多糖的提取分离及生物活性的研究较多，但通常是就某种单一茯
苓多糖独立展开，鲜见将不同茯苓多糖进行系列研究与比较的报道，故难以发现其中的规律与多糖产生功效的作用机制。

为了全面、系统地评价不同茯苓的质量，更好地控制茯苓品质，笔者从5个不同
产地(安徽安庆、安徽亳州、广西省、福建省和云南省)的茯苓中提取其主要活性成分——茯苓多糖，并对其抗氧化活性(清除羟基自由基能力、清除超氧阴离子自由
基能力及还原能力)进行研究，以期为茯苓品质的评价提供理论依据。

1 实验试剂和仪器
1.1 试剂
D-无水葡萄糖(购自中国食品药品检定研究院)、抗坏血酸(阿拉丁试剂)、邻菲罗啉(天津市光复精细化工研究所)、95%乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、磷酸氢二
钾上海中秦化学试剂有限公司)、磷酸二氢钾(上海中秦化学试剂有限公司)、
Tris(国药集团化学试剂有限公司)、焦性没食子酸(温州市瓯海精细化工有限公司)、三氯乙酸(国药集团化学试剂有限公司)、实验所用的茯苓(安徽安庆、安徽亳州、
广西省、福建省和云南省)购于药店。

1.2 仪器
HH-2数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)、Cary 100 Scan 紫
外可见分光光度计(美国Varian公司)、分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、烘箱(上海三发科学仪器有限公司)
2 实验方法
2.1 茯苓多糖的提取
称取不同产地的茯苓块各10 g，加95%乙醇脱脂(加热回流2次，每次1 h)。

脱
脂后，于40 ℃烘箱中干燥。

称取烘干后的茯苓3 g，加入0.8 mol/L NaOH，按
1︰30的料液比于4 ℃下浸提8 h，取上清，重复3次，合并3次所得提取液，
加入适量冰乙酸调pH至6，再加入3 倍量的95 % 乙醇，析出沉淀，离心，并用大量去离子水洗至中性，再依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，以流水在透析袋( 3 500 Da) 中透析48 h，去离子水中透析24 h后，低温干燥，即得茯苓多糖，
称重，计算得率。

粗多糖得率(%)=(W1/W2)×100% ，
(1)
其中：W1是提取所得干燥多糖的质量(g)； W2是称取干燥茯苓饮片的质量(g)。

2.2 茯苓多糖糖含量的测定
选用苯酚-硫酸比色法测5种不同产地茯苓多糖的糖含量。

标准葡萄糖溶液的配制：将葡萄糖标准品于105 ℃干燥30 min后，精密称取
1.01 mg，定容于10 mL容量瓶中，得0.101 mg/mL 标准液。

5%苯酚溶液的配制：称取5.001 2 g重蒸苯酚加蒸馏水定容于100 mL容量瓶中，转移至棕色试剂瓶中，避光保存，备用。

样品溶液的配制：分别精密称取各粗糖粉末2.5 mg加蒸馏水定容于25 mL容量
瓶中，配制成粗糖溶液，备用。

标准曲线的制作：分别准确移取0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 葡萄糖标准溶液于试管中并补加水至1.00 mL，加入1.00 mL 5%苯酚溶液并充分混匀，继续加入5.00 mL浓硫酸，充分混匀后，置于沸水浴中反应20 min，冷却后，于490 nm测其吸光度，并做葡萄糖浓度与吸光度的回归方程。

样品溶液的测定：分别精密移取1.00 mL不同产地的样品溶液(0.1 mg/mL)于试
管中，加入1.00 mL 5%苯酚溶液并充分混匀，继续加入5.00 mL浓硫酸，充分
混匀后，置于沸水浴中反应20 min，冷却后，于490 nm测其吸光度。

将测得的不同产地样品吸光度值带入上述所得的葡萄糖标准溶液回归方程，计算5种不同
产地茯苓多糖溶液的糖含量。

2.3 茯苓多糖清除羟自由基的测定[8]
分别移取浓度为2.5 mmo1/L的邻二氮菲溶液3.00 mL和 pH7.4的磷酸盐缓冲液2.00 mL 于10 mL容量瓶中，充分混匀后加入0.50 mL 15 mmo1/L FeSO4溶液，迅速摇匀；再分别加入1.00 mL各产地的茯苓多糖样品液和1.00 mL 0.1%的
H2O2溶液，最后用蒸馏水定容至10 mL；未损伤管不需要加样品溶液和H2O2；损伤管不加样品溶液；此外，以抗坏血酸作阳性对照。

在37 ℃保温1 h后取出，于510 nm处测吸光度，并计算清除率。

·OH清除率(%)=(A2-A1)/(A0-A1)×100% ，
(2)
式中A0：未损伤管的吸光度；A1：损伤管的吸光度；A2：样品溶液的吸光度。

2.4 茯苓多糖清除超氧自由基(O2-·)的测定[8]
分别移取4.50 mL Tris-HCl缓冲溶液于10 mL容量瓶中，预热20 min(20 ℃水浴)后，分别加入1.00 mL不同浓度的各产地茯苓多糖溶液和0.40 mL的 25 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀；25 ℃水浴反应5 min后，加入1.00 mL的 8
mol/LHCl溶液，使反应终止。

空白不加样品液，阳性对照选用抗坏血酸。

于299 nm处测吸光度，并计算清除率。

O2-·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100% ，
(3)
式中A0：未加样品时邻苯三酚吸光度；A1：加样品后邻苯三酚吸光度。

2.5 茯苓多糖还原能力的测定[9]
选用铁氰化钾还原法测5种产地茯苓多糖的还原能力，首先分别移取2.50 mL各
产地的不同浓度茯苓多糖样品溶液，依次分别加入提前配制好的2.50 mL pH=6.6的磷酸盐缓冲液和2.50 mL 1%的铁氰化钾溶液，充分混匀。

于50 ℃反应20
min后再加入10%的三氯乙酸溶液2.50 mL，3 000 rpm 离心l0 min；取上清液5.00 mL，分别加5.00 mL蒸馏水和1.00 mL 0.1% FeCl3溶液，于700 nm测吸光度，吸光度越大，还原能力越强。

空白对照不加样品液，阳性对照选用抗坏血酸，每个样品平行3份。

3 实验结果
3.1 不同产地茯苓多糖得率
来自不同产地的5种茯苓多糖提取率如图1所示，不同产地的茯苓多糖得率不同，但是在同一省份中，即安徽安庆和安徽亳州的茯苓多糖得率极为接近，都在65%
以上。

产于云南省的“云苓”多糖得率最高，达到78.5%；福建省的“闽苓”多
糖得率次之，为72.1%；广西茯苓产率最低，为37.3%。

图1 不同产地茯苓多糖提取率
3.2 不同产地茯苓多糖糖含量的测定
采用苯酚-硫酸比色法于490 nm，测定不同浓度葡萄糖的吸光度，并建立葡萄糖
浓度与吸光度间的回归方程为：Y=10.15X-0.000 2(X：mg/mL)，R=0.999 9(图2)。

将不同产地的茯苓多糖的吸光度代入标准曲线，计算各多糖糖含量，结果如图3所示，5种茯苓多糖的糖含量各有差异，其中最高的是云南茯苓，为69.00%；
福建茯苓次之，为57.92%；最低的是广西茯苓，为32.50%。

图2 标准葡萄糖溶液浓度与吸光度间的标准曲线
图3 茯苓多糖糖含量
3.3 清除羟自由基的测定结果
采用邻二氮菲法测定5种不同产地茯苓多糖对羟基自由基的清除能力，并以抗坏
血酸作阳性对照，结果见图4。

由图4可知，不同产地茯苓多糖及抗坏血酸的羟基自由基清除率都随着浓度的增大而增大，且抗坏血酸的清除率明显高于各产地的茯苓多糖。

当浓度为5 mg/mL时，安徽安庆和安徽亳州的茯苓多糖清除率分别为41.97%和39.55%，广西和福建茯苓多糖清除率分别为30.07%、28.14%，云南茯苓多糖清除率相对较高，为64.07%，阳性对照组抗坏血酸的清除率最高，为82.11%。

图4 不同产地不同浓度茯苓多糖对羟基自由基的清除率
3.4 清除超氧自由基的测定结果
采用邻苯三酚氧化法测定茯苓多糖对超氧自由基的清除能力，并以抗坏血酸作阳性对照，结果见图5。

由图5可知，不同产地茯苓多糖及抗坏血酸的超氧自由基清除率与其浓度呈正相关。

当浓度为5 mg/mL时，安徽安庆、安徽亳州及广西三个不同产地的茯苓多糖清除率分别为67.20%、67.06%、60.21%，福建和云南茯苓多糖清除率分别为71.65%和70.66%，略低于抗坏血酸清除率(81.83%)。

图5 不同产地不同浓度茯苓多糖及抗坏血酸对超氧阴离子自由基的清除率
3.5 还原能力的测定结果
采用用铁氰化钾还原法测5种不同产地茯苓多糖的还原能力，并以抗坏血酸作阳性对照，结果见图6。

由图6可知，5种不同产地的茯苓多糖均表现出一定的还原能力，且与茯苓多糖的浓度成正相关。

其中，安徽亳州、安徽安庆和福建省的茯苓多糖还原能力基本相同，云南茯苓多糖还原能力相对较高，而抗坏血酸的还原能力最高。

图6 不同产地不同浓度茯苓多糖及抗坏血酸的还原能力
4 结语
实验从5个不同产地的茯苓中提取茯苓多糖，采用苯酚-硫酸法测其糖含量，并采用三种不同体系的自由基清除实验研究其抗氧化活性。

实验结果表明，不同产地茯
苓药材中茯苓多糖的含量均有一定差异，以云南茯苓多糖的糖含量相对较高，且其抗氧化活性相对较强。

这可能与云南的气候，以及当地推行茯苓中药材基地化种植，从而保障茯苓中药材的质量有关[10]。

实验通过对三种不同体系的自由基清除率的测定，研究了各产地茯苓多糖的体外抗氧化性能，结果表明各茯苓多糖均具有一定的抗氧化能力，其具体机理推测如下：在清除·OH实验中，·OH可快速地攫取茯苓多糖碳氢链上的氢原子结合成水，而
茯苓多糖的碳原子上则留下一个成单电子，成为碳自由基，进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物[11]；在清除·OH实验中O2-·可与多糖发生
氧化反应，达到清除的目的；在还原能力测定实验中，体系自由基的基础基团为有机大分子，茯苓多糖分子容易捕获自由基并与其结合，因此显示出较强的还原能力[8]。

由于抗氧化作用与人类健康密切相关，茯苓作为药食两用传统中药大品种，应用历史悠久，在防治疾病和养生保健方面享有盛誉。

本文通过体外试验证明了茯苓多糖具有较强的抗氧化性能，以期为茯苓多糖进一步开发成特异性的抗氧化功能产品提供更充分的参考。

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