头孢克肟颗粒杂质检测的均匀设计及优化

头孢克肟颗粒杂质检测的均匀设计及优化
吴建伟$!!余俊先">
"$:浙江莎普爱思药业股份有限公司研发部!浙江平湖!=$E"##$":首都医科大学附属北京友谊医院药学部!北京!$###<##
中图分类号!?@"C 文献标志码!A 文章编号!$BC"D
"$"E ""#"##$#D $"$B D #<G H I !$#J $E##@K L :+00-:$BC"4"$"EJ "#"#J $#J #$C
摘!要!目的+采用均匀设计和]
T S 软件快速优化头孢克肟颗粒有关物质检测的方法!使系统适应溶液中已知杂质分离度达到基线分离%方法+采用均匀设计和]
T S 软件!根据模型提出检测方法的设计空间!以保留时间之差&!?’作为考察指标%结果+通过均匀设计和]
T S 软件处理!得到流动相可行的设计空间为7\l BJ <m #J "<!乙腈"=hm "h !"<h 四丁基氢氧化铵$#i $=O (!分离度较好%结论+采用均匀设计和]
T S 模型处理可以快速优化头孢克肟颗粒有关物质检测的方法!优化后的方法快捷有效%关键词!头孢克肟*均匀设计*]
T S 软件*设计空间U *.6)%>I $’./*-*0H #&.>.Q -&.)*6)%O >#+%.&3I $&$:&.)*)6($6.".>$?%-*+2$bX ]+’-‘5+$
&c X ])-d +’-"#$:G 57*:,1?505’2Q 6’-.G 5&5(,7O 5-*&^65L +’-3V6’7)’+0+S 6’2O ’Q 5)*+Q ’(8,:&Z *.&^65L +’-3S +-36)=$E"##&86+-’%":G 57*:,1S 6’2O ’Q /&U 5+L +-3a 2+5-.06+7
\,07+*’(A 11+(+’*5.*,8’7+*’(T 5.+Q ’(X -+&520+*/
&U 5+L +-3$###<#&86+-’$1A E 7F 1(7!H U ]%8W I 9%"X -+1,2O.50+3-’-.]T S0,1*‘’25‘525’.,7*5.*,f)+Q e(/,7*+O +k 5*65.5*5Q *+,-O 5*6,.,125(’*5.0)[0*’-Q 50+-Q 51+d +O 57’2*+Q (50&0,*6’**650/0*5OQ ’-’.’7**,*65250,()*+,-,1e-,‘-+O 7)2+*+50*,’Q 6+5&5[’05(+-5057’2’*+,-:T %W \H G V "X -+1,2O.50+3-’-.]T S0,1*‘’25‘525’.,7*5.&.50+3-07’Q 5,1.5*5Q *+,-O 5*6,.[’05.,-*65O ,.5(‘’072,7,05.&’
-.)05*65.+11525-Q 5+-25*5-*+,-*+O 5#!?$’0*65+-075Q *+,-+-.+Q ’*,2:%VX Z W V "W 62,)36)-+1,2O.50+3-’-.]T S0,1*‘’2572,Q 500+-3&*6515’0+[(5.50+3-07’Q 51,2O ,[+(576’05‘’07\l BJ <m#J "<&’Q 5*,-+*2+(5"=h m"h &"<h *5*2’[)*/(’O O ,-+)O 6/.2,d +.5$#4$=O (&‘+*63,,.250,()*+,-:8H ;8Z X VI H ;V "X 0+-3)-+1,2O.50+3-’-.]T SO ,.5(72,Q 500+-3Q ’-f)+Q e(/,7*+O +k 5*65.5*5Q *+,-O 5*6,.,125(’*5.0)[0*’-Q 50,1Q 51+d +O 57’2*+Q (50&*65,7*+O +k 5.O 5*6,.+0f)+Q e ’-.5115Q *+&54!G <H F I E !851+d +O 5%X -+1,2O.50+3-%]T S0,1*‘’25%G 50+3-07’Q 5
!工程师’研究方向"新药研发’%
4O ’+("k L 0/$E=BP$B=:Q ,O >通信作者"主任药师&博士’研究方向"药物制剂和临床药学’%4O ’+("L )-d +’-/)PQ Q O ):5.):Q -!!头孢克肟为第=代口服头孢菌素&临床上用于敏感菌引起的呼吸道感染*胆道感染及尿道感染等-$.
’+中华人民共和
国药典"二部,#"#$<年版$-".
首次收载了头孢克肟及其制剂&
美国药典#E#版$
-=.
*欧洲药典#FJ #版$-E .均有收载&欧洲药
典提供了有关杂质名称#A
*U *8*G *%和a $及其结构式&但未提供分离各已知杂质的色谱参数’本课题组前期研究建立了有关杂质的检测方法&但是在检测影响因素#B#u 放置=#.&E#u 放置=#.$样品时&出现了未知杂质&其中一个未知杂质与杂质U 分离度无法基线分离&另外系统适应性溶液中已知杂质分离度不能完全达到基线分离&仍有优化空间’本研究采用均匀设计优化了方法&并通过]T S 软件-<4F .
&建立模型&根
据模型提出可行的设计空间’
JK 材料与方法
JN JK 药品与试剂
待测样品"头孢克肟待测样品#纯度@FJ
Ch &批号为_$F#"#$a &莎普爱思药业股份有限公司$’标准品"头孢克肟对照品#纯度F@J
#h &批号为Y bY $C#"#C@&自标$&杂质A 对照品#纯度@FJ
#h &批号为S I U Y b4A &S 6’2O ’Q 5)*+Q ’(865O +0*2/Z ’[,2’*,2/8,:&Z *.&X VA $&杂质U 对照品#纯度@"J $h &批号为"C<C4#"$A $$&W Z 8S 6’2O ’Q 5)*+Q ’(V*’-.’2.0Z *.&8A ;$&杂质8对照品#纯度@FJ
#h &批号为S A 84#EC4$#&A ,k 5’(852*+1+5.V*’-.’2.0&I -Q &X VA $&杂质G 对照品#纯度@Fh &批号为S I W U Y b4G &S 6’2O ’Q 5)*+Q ’(Q 65O +0*2/Z ’[,2’*,2/8,:&Z *.&X VA $&杂质%对照品#纯度@@J $h &批号为$C$""$4"&S 6’2O ’Q 5)*+Q ’(865O +0*2/Z ’[,2’*,2/8,:&Z *.&X VA $&杂质a 对照品#纯度@FJ
<h &批号为A 4#"&S 6’2O ’Q 5)*+Q ’(Q 65O +0*2/Z ’[,2’*,2/8,:&Z *.&X VA $’乙腈#色谱纯&批号为$F#$<#@C &
W5.+’8,:&I-Q&X VA$%磷酸二氢钾#分析纯&批号为"#$C#"$#&北京化工厂$%氢氧化钠#分析纯&批号为"#$C#<$F&北京化工厂$%"<h四丁基氢氧化铵#W U A&分析纯&批号为"#$F#$$=&天津光复精细化工研究所$’
JN CK仪器
Z84"#A G4S G A型高效液相色谱仪#日本岛津公司$% S G A"#A型高效液相色谱仪#日本岛津公司$&紫外检测器&光电二极管检测器%A U$=<4V型十万分之一电子天平#T%W W Z%? W H Z%G H公司$%U VA$"EV48b型千分之一电子天平#赛多利斯科学仪器有限公司$%a_4=$"4##$K a_4=$"4##"型7\计#雷磁科学仪器有限公司$’
CK方法
CN JK色谱条件及溶液配制
"J$J$!色谱条件"V+(M255-色谱柱#"<#O O v EJ B O O&<&O$&柱温E#u&流速$J#O(K O+-&进样体积$#&(&紫外检测波长"<E-O’
"J$J"!溶液配制"#$$磷酸盐缓冲液#7\l CJ#$&取磷酸二氢钾#J BF3&加#J$O,(K Z氢氧化钠溶液"@J$O(&用水稀释至$##O(&即得’#"$杂质定位母液&取杂质A1a各适量&精密称定&分别用溶剂溶解并稀释制成每$O(约含杂质A*U*8* G*%及a各$##&3’#=$杂质定位溶液&精密量取杂质定位母液各$O(&分别置于$#O(容量瓶中&用溶剂稀释至刻度&摇匀’#E$空白辅料溶液&精密称取空白辅料约@<#O3&置于<#O(容量瓶中&加溶剂溶解并稀释至刻度&摇匀&过滤&即得’#<$系统适用性溶液&精密称取对照品约$#O3&精密量取杂质A1a定位溶液各$O(&置于同一$#O(容量瓶中&加溶剂溶解并稀释至刻度&摇匀&即得’#B$供试品溶液&取E#*B#u的=#.样品适量&加溶剂溶解并稀释制成每$O(约含头孢克肟$O3的溶液&作为供试品溶液’取上述溶液各$#&(&分别注入液相色谱仪’
"J$J=!均匀试验设计"+中华人民共和国药典,收载的头孢克肟有关物质方法色谱柱为8$F柱&流动相为W U A溶液#取$#h 的W U A溶液"<O(&加水$###O(&用磷酸调节7\为CJ#$4乙腈#7w7l C"w"F$’头孢克肟结构中有"个羧基&根据文献-@.& 7Y’
$
l"J$##针对羧基$*7Y’
=
l=J C=#针对羧基甲氧基亚氨基$&7\g其7Y’"个单位时&羧基均解离&在溶液中带负电荷&与W U A形成离子对&头孢克肟及其杂质可能由于羧基的7Y’不同&流动相的W U A浓度不同而提供不同的选择性&另外有机相比例也会对各物质保留及分离产生影响’故选择7\*W U A 及乙腈比例为考察因素&见表$’
表JK因素及水平表
7-;JKR-:&)%-*02$T$2&-;2$
因素水平
7\<J<<J F BJ$BJ E BJ C CJ#
W U A K O(=<C@$$$=
乙腈K h$<"#"<"F=#="
!!设计的流动相条件见表"&考察可能对分离度影响较大的=个因素"7\*W U A及乙腈’
表CK均匀试验设计
7-;CKU*.6)%>$"#$%.>$*&-20$’./*
试验编号7\W U A K O(乙腈K h
$<J<<"<
"<J F@="
=BJ$$="#
E BJ E==#
<BJ C C$<
B CJ#$$"F
LK结果
选择分离度为考察指标&但不同色谱条件下&峰顺序可能发生变化&分离度均为正数&在模型上无法反映出峰顺序颠倒’通常两色谱峰保留时间差g"O+-可以较好的分离&暂选择不易分离的关键峰对&其保留时间之差#!?$作为考察指标’系统适用性中杂质峰的出峰时间*供试品中与杂质U相邻的未知杂质出峰时间及关键峰对的保留时间之差见表=’
表LK保留时间或保留时间差">.*#
7-;LKF$&$*&.)*&.>$)%%$&$*&.)*&.>$0.66$%$*:$">.*#
编号未知杂质杂质A$杂质A"杂质U杂质8杂质G杂质%杂质a主峰!?#主峰4杂质G$!?#杂质U4未知杂质$!?#杂质a4杂质%$ $=CJ F@C ECJ$#E<#J=<=CJ##$<<J"""==J="@E<J@<=EEJ CEB==J BE D#J=$$D#J F@B D$J"#C "$=J$<E="J F$==CJ"C"$=J B$E<"J@FC$@J E=$$"J ECE$=J E"=$FJ@E"#J EF@#J EB#J@E@
=@J@E"E"J"$<EBJ BC=$BJ E"@<$J EE=CJ BF"=J#EB"FJ<"$=EJ B@""J@FF BJ EFC<J EC<
E$#J CCC"=J#"$"=J#"$$=J#$B"@J"E<$FJ=<$$J"#@$<J$#C$BJ F@$$J E<@"J"=@=J F@F
<$"J@#==BJ@$$=@J EC"$=J<"@=<J#BC==J B$C$EJ$"$$"J#=<"EJ$<C@J EB#J B"B D"J#FB
B$EJ$F"FJ$FF"FJ$FF$EJ$C<="J F@F"<J@=<$"J@C@$<J E$"$@J E@C BJ E=F D#J##<"J E==
!!注"杂质A$*杂质A"为杂质A的异构体
;,*5"+O7)2+*/A$’-.+O7)2+*/A"’25*65+0,O520,1+O7)2+*/A
!!主峰及杂质G*杂质U及未知杂质*杂质%及杂质a保留时间接近&不易分析&将这=对作为关键峰对&其保留时间之差分别表示为!#主峰4杂质G$*!?#杂质U4未知杂质$*!?#杂质a4杂质%$’采用]T S软件以标准最小二乘法回归分析’各回归模型见图$’
可见&!?#主峰4杂质G$主要受7\影响&!?#杂质U4未知杂质$主要受W U A用量及乙腈交互作用影响&!?#杂质a4杂质%$影响因素为各因素主效应及W U A用量与乙腈的交互作用’各影响因素的影响曲面图见图"1E’
7\为影响!?#主峰4杂质G$的显著因素&7\在<J<i C 时&7\越大&!?#主峰4杂质G$越大&见图"’
7\与W U A交互作用为影响!?#杂质U4未知杂质$的显
A:!?#主峰4杂质G$模型参数%U:!?#杂质U4未知杂质$模型参数%
8:!?#杂质a4杂质%$模型参数
A:!?#T’+-75’e4I O7)2+*/G$O,.5(7’2’O5*520% U:!?#I O7)2+*/U4X-e-,‘-I O7)2+*/$O,.5(7’2’O5*520% 8:!?#I O7)2+*/a4I O7)2+*/%$O,.5(7’2’O5*520%
图JK模型回归参数
R./JK9)0$2%$/%$’’.)*#-%->$&$%
’
图CK!F"主峰\杂质I#曲面图
R./CKE+%6-:$/%-#8)6!F"9-.*#$-_\O>#+%.&3I
#
图LK!F"杂质A\未知杂质#曲面图
R./LKE+%6-:$/%-#8)6!F"O>#+%.&3A\U*_*)5*O>#+%.&3#
著因素&W U A用量低时&乙腈比例越高%W U A用量高时&乙腈比例越高&!?#杂质U4未知杂质$越大&见图=’
7\*W U A*乙腈及W U A*乙腈的交互作用为影响!?#杂质a4杂质%$的显著因素&当固定7\l BJ<&W U A用量低时&乙腈比例越高%W U A用量高时&乙腈比例越高&!?#杂质a4杂质%$越大&见图E’当!?#主峰4杂质G$*!?#杂质U4未知杂质$* !?#杂质a4杂质%$均g"O+-时&等高线图见图<1C’W U A为$=O(时&在白色区域中-模型预测!?#主峰4杂质G$*!?#杂质U4未知杂质$*!?#杂质a4杂质%$均g"O+-.可选择7\l BJ<*乙腈"=h为中点&设计空间为7\l BJ<m#J"<%乙腈为"=hm"h&见图<’
W U A为$#O(时&在白色区域中-模型预测!?#主峰4杂质G$*!?#杂质U4未知杂质$*!?#杂质a4杂质%$均g"O+-.可选择7\l BJ<*乙腈"=h为中点&设计空间为7\l BJ<m#J"<%乙腈为"=hm"h&见图B’
W U A为F O(时&模型预测!?#主峰4杂质G$*!?#杂质U4
图MK !F "杂质R \杂质!
#曲面图R ./MKE +%6-:$/%-#8)6!
F "O >#+%.&3R \O >#+%.&3!
#图SK7A 1JL >2等高线图R ./SK()*&)+%>-#)67A 1JL >2
未知杂质$*!?#杂质a 4杂质%$均g "O +-的区域已不存在’综上&流动相可行的设计空间之一为7\l BJ <m #J "<&乙腈为
图XK7A 1JD >2等高线图R ./XK()*&)+%>-#)67A 1JD >
2
图aK7A 1‘>2等高线图R ./aK()*&)+%>-#)67A 1‘>2
"=hm "h &W U A 为$#i $=O (&见图C ’采用7\l BJ <&乙腈"=h &W U A $=O (&分离度较好&见图F 1@
’
图‘K 优化后系统适用性图
R ./‘KE 3’&$>’+.&-;.2.&30.-/%->-6&$%)#&.>.Q -&.)*
上曲线为B#u*=#.样品%下曲线为E#u*=#.样品
)7752Q)2&5+-.+Q’*500’O7(5‘+*6B#u’-.=#.%(,‘52Q)2&5+-.+Q’*500’O7(5‘+*6E#u’-.=#.
图cK影响因素样品色谱图
R./cKE->#2$:8%)>-&)/%->)6.*62+$*:.*/6-:&)%’
MK讨论
在新药研究领域&工艺优化*处方筛选的过程中需要对多影响因素及水平进行比较&考察其对结果的影响并优化’目前的相关研究多采用正交设计*均匀设计和效应面法对条件进行优化’正交设计是利用一套系统的正交表将多因素和多水平进行组合均匀搭配&合理安排&从而减少实验次数&同时提供较多的信息-$#.’均匀设计&又称均匀设计试验法&或空间填充设计&是基于数论方法推导出来的一种实验设计方法-$$4$<.’效应面法是利用实验设计并通过实验得到一定数据&采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系&通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数&解决多变量问题的一种统计方法-$B4$C.’
从整体评价来看&效应面法要优于均匀设计法和正交设计法&均匀设计法优于正交设计法&效应面法在多因素*多水平的试验方面比均匀设计法更全面&比正交试验法更简化’均匀设计与正交设计相比&更适用于多因素多水平的试验&进一步增强正交设计实验点在空间具有(均匀分散性)的优点&与效应面法相比对一般效应值出现在最佳实验条件区域附近的变化较为灵敏’根据均匀设计法在这一方面的突出特性&本研究将均匀设计应用到头孢克肟颗粒的杂质检测&得到了方法可行的设计空间’本研究结果表明&采用均匀设计和]T S模型处理可以快速优化头孢克肟颗粒有关物质检测的方法&且优化后的方法快捷有效’
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