细胞生物学笔记-第三章细胞生物学研究方法
细胞生物学研究方法
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6
公司名称
举例：过氧化物酶 peroxidase ,(POX) 1.原理
血细胞中的POX能分解H2O2而释放出新生态氧，后者 可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。 2.正常阳性细胞: ①. 中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。 ②. 嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性。 ③. 单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。
› 转染（transfection）：将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。
› 在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达（over-expression），从而实现 上调细胞中的目的基因表达。
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29
公司名称
（一）外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要 方式
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› 应用：用于显示特定蛋白质的细胞内的定位，间接研究蛋 白之间的相互作用。
› 原理：当荧光工体与荧光受体分子彼此接近而供体的发射 光谱与受体的激发光谱重叠时就会通过偶极子相互作用， 实现了能量向邻近的受体分子转移，一种非辐射能量跃迁， 通过荧光显微镜可以观察到这种改变。
› 特点：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光 光谱与受体的激发光谱要重叠。
› 缺点：只能说明两个蛋白之间有相互作用的结构基础，并不标示这两 个蛋白在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞中确实存在，需 要用免疫共沉淀进行验证。
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公司名称
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公司名称
› （三）吞噬体展示可筛选存在相互作用的蛋白质 › 被筛选蛋白cDNA与噬菌体的衣壳蛋白DNA构建成融合基因，使被筛
›
光或改变本身荧光的发射波长与强度，从
而
›
通过荧光检测可以显示该离子的量。
细胞生物学第三章细胞生物学研究方法知识讲解
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
步骤
– 适宜的放射性前体分子标记机体或细胞 – 常规制片 – 暗室敷乳胶(核子乳胶3-10m) – 暗盒暴光或自显影 – 显影、定影、观察
与显微自显影区别
敷胶要单层晶体 暴光时间长
定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收， 测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞 内的含量 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 BACK
0.2 m
电子显微镜技术(Electro microscopy)
0.2nm
扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)
3nm, 0.7nm
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope)
（侧0.1-0.2，纵0.001nm）
BACK
光学显微镜技术
自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基 绿、吖啶橙)
优点：
– 多种成分定位 – 只有激发荧光可成像，敏感度高 – 染色简便 – 标本呈彩色图像 – 固定细胞和活细胞
数字成像显微技术
图像后期处理，提高信/噪比、放大信号 摄像机和计算机 原理：摄取同一区域多幅图像，信号经
计算机放大、假信号减弱或消除
BACK
扫描遂道显微镜原理
量子力学中的隧道效应，即在低电压下，二电 极之间具很大阻抗，阻止电流通过(势叠)
当二电极间近到一定距离时，电极间产生了电 流(隧道电流)，且Iexp(-2Kd)，d为针尖与样品 间距离，K为常数，d转化为I的函数而被测定
扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产 生彼此间相互作用力，并在计算机显示出来，从 而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等
第3章 细胞生物学的研究方法1(显微镜技术)
显微镜技术
显微镜的成像原理
无论是何种显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素：照 明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统。
光源 聚光镜 样品 物镜
光源 透镜
射线扫描器
聚 光 镜
样品
目镜
电视屏观 察图像
直接成像
荧光屏观察 图像
光学显微技术
在细胞生物学的领域中，光学显微镜作为研究细胞显微
结构的重要工具和手段是应用最早也是最广的一种。光学显 微镜是利用可见光作光源，通过一组玻璃透镜包括目镜、物 镜、聚光镜放大被观察物体，提高分辨率的仪器。分辨率指： 人眼在25厘米的明视距离处分辨物体结构最小间距的能力。
载物台的上方：
光源
长焦距聚光器 载物台的下方： 物镜 应用：直接对培养的 细胞进行观察
荧光显微镜
原理:
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线， 并发射出比原来吸收波长更长的光。
紫外光 可见光 红外光
λ short
long
基本构造：
A 光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光
透射电镜生物标本制备过程 (自学）
(1)取材
(2)固定:防止产生结构改变。 戊二醛：在蛋白质分子之间形成共价键, 将它们交联在一起。 四氧化锇：除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。 (3)脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜生物标本 不能含水。梯度乙醇。 (4)包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、 电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 (5)切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚薄片。约为细 胞的1/200厚度。 (6)染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力 弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进行染 色。重金属浸染。
细胞生物学细胞生物学研究方法
Methodology of Cell Biology
Cells are (relatively) small and complex. How do we study them?
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 显微技术 • 一、光学显微镜
• 二、电子显微镜
• 三、显微操作技术 第二节 细胞分离与细胞培养 第三节 细胞及其组分的分析方法 第四节 细胞生物学研究常用的模式生物
antibodies for immunocytochemistry
Immunofluorescence staining for Golgi (blue) actin (green) histones (red)
颜色†
吸收 光谱 (nm)
发射 光谱 (nm)
Alexa Fluor 蓝色 350 — 405 紫色 — 430 绿色 — 488 蓝绿色 — 500 绿色 — 514 绿色 — 532 绿色 — 546 黄色 — 555 黄绿色 — 568 橙色 — 594 橙红色 — 610 红色 — 633 红色 — 647 红色 — 660 红色 — 680 红色 — 700 红色 — 750 红色
4. 绿色荧光蛋白
Fluorescence microscopy exploits special molecules called fluorophores（荧光团）
Fluorescent dyes/fluorophores absorb light (energy) of a specific color (wavelength)
收特定波长的短波光线，并发射 出比原来吸收波长更长的光。
照明方式通常为落射式
细胞生物学研究方法
细胞生物学研究方法细胞生物学是研究细胞结构、功能和过程的科学学科，主要研究对象是细胞的组成、分裂、分化、代谢、运动、增殖和死亡等。
为了深入研究细胞相关问题，细胞生物学采用了多种研究方法。
第一，显微镜观察法。
显微镜是细胞生物学中最常用的工具之一。
通过显微镜观察，可以观察到细胞的形态、结构和各种细胞器的分布情况。
常用的显微镜有光学显微镜和电子显微镜。
光学显微镜适用于观察活细胞，电子显微镜适用于观察细胞内部细节，如细胞核、线粒体和内质网等。
第二，细胞培养法。
细胞培养是指将细胞在无菌条件下培养于含有营养物质的培养基中，使其持续生长和繁殖。
通过细胞培养，可以研究细胞的生长特性、分裂过程以及对外界刺激的反应。
常用的细胞培养方法有原代培养、细胞株培养和三维培养等。
第三，细胞分离和纯化法。
细胞分离和纯化是将不同类型的细胞从混合细胞群中分离出来，以便对某种细胞进行独立的研究。
常用的方法有细胞悬浮液经过离心分离、细胞表面标记技术以及细胞排序等。
第四，分子生物学技术。
分子生物学技术可以用于研究细胞的基因表达、代谢等分子机制。
其中，PCR技术可以复制DNA序列，用于检测细胞内特定基因的存在和表达水平。
原位杂交技术可以检测细胞内特定mRNA的定位和表达情况。
第五，蛋白质分析技术。
蛋白质分析技术主要用于研究细胞内蛋白质的分布、结构和功能。
常用的方法有蛋白质电泳、质谱分析、免疫印迹等。
第六，遗传学方法。
遗传学方法可以用于研究细胞的遗传特征和突变。
如基因敲除和基因敲入技术可以研究基因在细胞中的作用；细胞杂交技术可以研究细胞核酸的互补性和杂交情况。
细胞生物学研究方法的不断更新和发展，使我们对细胞的理解越来越深入。
这些方法的应用使得我们能够更好地揭示细胞的机制和功能，为解决许多重大疾病和生物学问题提供了有力的工具。
细胞生物学笔记
第三章细胞生物学研究方法一. 名词解释：1.细胞株从原代培养物中接种出来的一群不均一的细胞群（染色体数目不变，不能无限长期传代、繁衍）。
2.细胞系细胞系一般都是转化细胞，可以无限传代长期繁衍下去，每种细胞系都具有特殊的遗传标志特征，3.接触抑制当贴壁生成单层细胞且细胞达到一定密度相互接触时，造成细胞表面许多反应受到遮蔽，从而细胞的生长和繁殖受到抑制。
4.电融合技术将悬浮细胞在低压交流电场中聚集成串珠状细胞群或相互接触的单层培养细胞，加高压电泳冲促使融合的技术。
5.密度梯度离心离心操作如果在一种连续密度梯度介质中进行，6.差速离心装有不均一粒子的离心管在离心机中高速旋转时，大小、密度不同的粒子将以各自的沉降速率移向离心管底部7.细胞克隆由单个细胞培养繁殖而成的一群遗传性状完全相同的细胞群体。
二. 简答题:1.透射电镜、扫描电镜、扫描隧道显微镜的原理2.细胞及细胞器分离提纯方法细胞：采用流式细胞术；细胞器：超速离心术，差速离心术，密度梯度离心术，蔗糖密度梯度离心术，氧化铯密度梯度离心。
3.动物细胞培养方法液体悬浮培养，平板培养，回转玻璃管培养。
4.单克隆抗体技术及优点单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用，正常的淋巴细胞具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不能分泌抗体，将两细胞融合成杂交瘤细胞这样既能合成抗体，又能在体外无限繁殖，优点：永久性产生，特异性强，5.如何利用细胞杂交技术由不纯的抗原制备纯的抗体6.免疫荧光技术及应用7.相差显微镜的原理其基本原理是吧透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构中的对比度，使各种构造变得清晰可见。
第四章细胞质膜与细胞表面● 1. 成斑现象. 2. 成帽现象.● 3. 连接子. 4. 化学突触. 4.“多莉”克隆羊的问世对细胞生物学研究有何意义？1、首次证明了哺乳动物成体细胞的细胞核仍保持有细胞全能性；2、首次证明了哺乳动物特化细胞的发育潜能是有可能在人为条件下发生逆转的，；3、证明了动物克隆并不是100%的复制。
第三章细胞生物学技术
构造上，相差显微镜不同于光镜之处：
1、环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器 的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
2、相位板（annular phaseplate）在 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将 直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased.
暗视野显微镜光学显微镜受照射光波长的限制在可见光下其分辨极限只有02m即使在紫外光下最大分辨率也只有01要观察更精细的结构只有借助分辨率更高的电子显微镜
第三章 细胞生物学研究方法
Chapter 3 Techniques in Cell Biology
第一节 显微技术
细胞生物学的建立和发展得益于光学显 微镜的发明； 电子显微镜的发明使对细胞结构和功能 的研究达到了新的水平。
Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrulastage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.
细胞生物学翟中和完美版笔记
细胞生物学教案. 第一章绪论第一节细胞生物学研究内容与现状一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科1.细胞学（Cytology）：是研究细胞的结构、功能和生活史的科学2.细胞生物学（Cell Biology）：运用近代物理学和化学的技术成就以及分子生物学的概念与方法，从显微水平、亚显微水平和分子水平三个层次上，研究细胞的结构、功能及各种生命活动规律。
二、细胞生物学的主要研究内容1. 细胞核、染色体及基因表达基因表达与调控是目前细胞生物学、遗传学和发育生物学在细胞和分子水平相结合的最活跃领域。
2.生物膜与细胞器的研究膜及细胞器的结构与功能问题（“膜学”）。
3. 细胞骨架体系的研究胞质骨架、核骨架的装配调节问题和对细胞行使多种功能的重要.性。
4. 细胞增殖及调控控制生物生长和发育的机理是研究癌变发生和逆转的重要途径（“再教育细胞”）。
5. 细胞分化及调控一个受精卵如何发育为完整个体的问题。
（细胞全能性）6 .细胞衰老、凋亡及寿命问题。
7. 细胞的起源与进化。
8. 细胞工程改造利用细胞的技术。
生物技术是信息社会的四大技术之一，而细胞工程又是生物技术的一大领域。
目前已利用该技术取得了重大成就（培育新品种，单克隆抗体等），所谓21世纪是生物学时代，将主要体现在细胞工程方面。
三、当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域1. 染色体DNA与蛋白质相互作用关系；2. 细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控；3 .细胞信号转导的研究；4 .细胞结构体系的装配。
第二节细胞生物学发展简史一细胞生物学研究简史1.细胞学创立时期 19世纪以及更前的时期（1665—1875），是以形态描述为主的生物科学时期；2. 细胞学经典时期 20世纪前半世纪（1875—1900），主要是实验细胞学时期；3. 实验细胞学时期（1900—1953）；4. 分子细胞学时期（1953至今）。
总过程概括为：细胞发现→细胞学说建立→细胞学形成→细胞生物学的发展（1665）（1838—1839）（1892）（1965）R.Hooke Schleiden、Schwann Hertiwig DeRobertis二、细胞的发现（discovery of cell）以及细胞学说的建立及其意义（The cell theory）1.1838年，德国植物学家施莱登（J.Schleiden）关于植物细胞的工作，发表了《植物发生论》一文（Beitrage zur Phytogenesis）.2.1839年，德国动物学家施旺（T.Shwann）关于动物细胞的工作，发表了《关于动植物的结构和生长一致性的显微研究》一文，论证了所有动物体也是由细胞组成的，并作为一种系统地科学理论提出了细胞学说。
第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法一．名词解释1.福尔根反应：特异显示DNA分布的反应。
酸水解可除去RNA，仅保留DNA，冰出去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键上的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。
所暴露的自由醛基与西夫试剂反应呈紫红色。
2.负染色：用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。
染色后，在电镜下观察时，被观察的对象为亮的，背景为暗的，反衬出样品中的生物大分子及其复合物的形态。
3.原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特意核苷酸序列在染色体上火细胞中的位置的方法。
4.原代培养：直接从动物体内获取细胞进行首次培养，称原代培养。
5.传代培养：原代培养的细胞在一个容器中增殖到一定的密度后，将细胞分散到多个容器中继续培养的方式称传代培养。
6.细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，一般可顺利地传40-50代次，它保持染色体二倍体的数量及接触抑制行为。
7．细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，使其获得“不死性”特征，从而无限增殖，从正常组织或胚胎组织也可以建立细胞系，这是一个含有多个细胞谱系的混杂细胞群体。
8.探针：带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段，用于核酸分子杂交技术以检出标本中待测核酸分子。
9.超薄切片：是一种主要的透射电子显微镜制样技术，利用超薄切片机将样品切成40-50nm 左右，穿透很弱的电子束才能透过。
其主要步骤为：固定、脱水、包埋、切片、染色。
二．填空1、细胞生物学常用的光镜有相差显微镜、微分干涉显微镜、和荧光显微镜。
2、利用超速离心机对细胞组分进行分级分离的常用方法有差速离心和密度梯度离心。
3、单克隆抗体技术是将B淋巴细胞与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。
4、对电镜观察的生物样品有_要求样品很薄和保持样品的精细结构5、贴壁生长的细胞具有三个特点：单侧生长、形态多变、接触抑制。
第三章细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法一、是非判断1．提高显微镜的分辨率，可通过缩短波长，或给标本染色。
2．光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者，所以能看到更小的细胞结构。
3．亚显微结构就是超微结构。
4．电子显微镜的镜筒中是真空的，其目镜与光学显微镜的目镜也有很大区别。
5．在电子显微镜下观察细胞核时用碱性品红染色，染色质被染成红色。
6．为了使光学显微镜或电子显微镜标本的反差增大，可用化学染料对标本进行染色。
7．生物样品的电子显微镜分辨率通常是超薄切片厚度的十分之一，因而切得越薄，照片中的反差越强，分辨率也越高。
8．透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。
9．CsCl密度梯度离心法分离纯化样品时，样品要和CsCl混匀后分装，离心时，样品中不同组分的重力不同，停留在不同区带中。
10．用免疫荧光技术可显示与酶解过程有关的酶是否结合在微管上。
11．用带有标记的特定核酸分子作探针，测定与之互补的染色体DNA区段的位置，称为原位杂交。
12．Western blotting是体外分析RNA的技术。
13．进行流式细胞术时，所用的细胞需染色，而且还需对组织块中的细胞进行分散处理。
二、选择1．要观察肝组织中的细胞类型及排列，应先制备该组织的( )。
A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片2．小鼠骨髓细胞染色体标本一般制备成细胞的( )。
A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片3．观察血细胞的种类和形态一般制备成血液( )。
A．滴片D．切片 C．涂片 D．印片4．提高一般光学显微镜的分辨能力，常用的方法有( )。
A．利用高折射率的介质(如甘油) B．调节聚光镜，加红色滤光片C．用荧光抗体示踪D．将标本染色5．下列( )与显微镜能达到的分辨率无关。
A．光波波长B．物镜的放大倍数C．标本和透镜之间的物质的折射率D．透镜的数值孔径6．适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是( )。
A．扫描电镜B．荧光显微镜C．相差显微镜D．倒置显微镜7．用于观察活细胞的显微镜是( )。
细胞生物学-3细胞生物学研究方法
02
Charged Plates
Fluorescence Activated Cell Sorting
添加标题
1
添加标题
2
+
添加标题
3
Single cells sorted into test tubes
添加标题
4
FALS Sensor
添加标题
5
Fluorescence detector
应用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结合，因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。
免疫胶体金标定(Immunogold labeling)
利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以观察蛋白质的分布区域。
基本原理： 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。
吸附机理：因胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。
细胞培养
在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。
人的细胞培养
细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。 细胞株: 通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的传代能力。
细胞生物学-第3章-细胞生物学研究方法(翟中和第四版)
基础上，添加 “环状光阑”和
“相差板”，将光程差或相位差， 转换成振幅差。 • 这是在构造上，相差显微镜不同于 普通光学显微镜两个特殊之处。
体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A） 和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
甲醛
石蜡
5μm
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
相差显微镜
发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微 镜，并获得诺贝尔奖。
原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变 成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间 的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。
（Байду номын сангаас）荧光显微镜——基本原理
特点： 1. 利用汞灯或氙灯作为荧光激 发光源，波长较短，分辨 率高于普通显微镜； 2 . 核心部件是滤光片系统及专 用物镜镜头； 3. 滤光片系统由激发滤光片和 阻断滤光片组成。 应用： 对细胞内生物大分子进行 定性、定位研究。
520~560nm的 绿色荧光透过
阻断滤光片
用超速离心技术分离细胞组分
组织匀浆
差速离心
密度梯度离心
分离出各组分
用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分
密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
二、细胞成分的细胞化学显示方法
• 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 • 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、 核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量
福尔根反应 Feulgen stain
细胞生物学的研究方法(1)
编辑课件 光学显微镜和电子显微镜下的细胞3结构
2、分辨率(resolution)
R = 0.61λ/n Sinα n=介质的折射率 ；空气为1. 油为1.5 α=样品对物镜角孔径的半角；sinα的最大值为1 λ=照明光源的波长 0.61是一个恒定的参数；表示成像的点虽被重叠但仍能 被区别的程度
1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明
DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarki contrast microscope）
利用的偏振光 ;标本可略厚，折射率差别更大
基因注入、核移植、转基因等的显微操作
编辑课件
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（八）、倒置显微镜
倒置显微镜特点: 物镜与照明系统颠倒 观察培养的活细胞 具有相差物镜
1）自发荧光
细胞中有些物质（如叶绿素等）紫外线照射后可 发荧光
2）诱发荧光
一些物质紫外线照射后不能发荧光，但如果用荧 光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发
荧光
编辑课件
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荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
编辑课件
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2、荧光显微镜和普通显微镜的区别
1）照明方式： 通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上
（四）、暗视野显微镜
暗视野显微镜(dark field microscope) 用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大 在黑暗的背景下呈现明亮的像 反差增大，分辨率提高 观察未经染色的活体或胶体粒子
编辑课件
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（五）、相差显微镜
相差显微镜（phasecontrast microscope）
荷兰人Zernike1932年发明，获1953年诺贝尔物理奖 作用：可观察未经染色的标本和活细胞
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第三章细胞生物学研究方法
如何学习细胞生物学？
•抽象思维与动态观点
•结构与功能统一的观点
•同一性(unity)和多样性(diversity)的问题
•细胞生物学的主要内容：
结构与功能（动态特征）；
细胞的生命活动；
•实验科学与实验技术——细胞真知源于实验室
——What we know//How we know.
第三章细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法
细胞组分的分析方法
细胞培养、细胞工程与显微操作技术
第一节细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术（light microscopy）
电子显微镜技术(Electro microscopy)
扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope）
扫描遂道显微镜(scanning tunneling microscope )
第二节细胞组分的分析方法
离心分离技术
细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法
特异蛋白抗原的定位与定性
细胞内特异核酸的定位与定性
放射自显影技术
定量细胞化学分析技术
第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术
细胞的培养
细胞工程
一、光学显微镜技术（light microscopy)
普通复式光学显微镜技术
荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）
激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy）
相差显微镜（phase-contrast microscope）
微分干涉显微镜
（differential interference contrast microscope, DIC）
录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
二、电子显微镜技术
电子显微镜的基本知识
电镜与光镜的比较
电镜与光镜光路图比较
电子显微镜的基本构造
主要电镜制样技术
负染色技术
冰冻蚀刻技术
超薄切片技术
电镜三维重构技术
扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）
SPM(Scanning probe microscope)
三、扫描遂道显微镜
Scanning Probe Microscope,SPM
(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)
包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等
原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如
量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，
并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电
特性或磁特性等。
装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。
特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。
（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；
（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；
（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。
（4）可连续成像，进行动态观察
用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。
普通复式光学显微镜技术
光镜样本制作
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离
荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）
原理与应用
直接荧光标记技术
间接免疫荧光标记技术
在光镜水平用于特异蛋白质
等生物大分子的定性定位：
如绿色荧光蛋白(GFP)的应用
激光共焦扫描显微镜技术
（Laser Scanning Confocal Microscopy）
原理
应用：
排除焦平面以外光的干扰，增强
图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，
可重构样品的三维结构。
相差显微镜（phase-contrast microscope）
将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞
微分干涉显微镜（differential-interference microscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成
明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。
适于研究
活细胞中较大的细胞器
录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活
细胞中的颗粒及细胞器的运动
电镜与光镜的比较
主要电镜制样技术
超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图
负染色技术（Negative staining）与金属投影
染色背景，衬托出样品的精细结构
冰冻蚀刻技术（Freeze etching）（技术示意图）
冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。
快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） 电镜三维重构技术
电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的
具有重要应用前景的一门新技术。
电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振
分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）
——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。
扫描电镜
原理与应用：
电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。
CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张
力问题
一、离心分离技术
用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分
密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
二、细胞内核酸、蛋白质、
酶、糖与脂类等的显示方法
原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些
特殊基团特异性结合的特征，通过显
色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来
判断某种物质在细胞中的分布和含量。
Feulgen Staining
三、特异蛋白抗原的定位与定性
免疫酶标技术
免疫胶体金 免疫荧光技术：
快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限（图） 蛋白电泳(SDS-PAGE)
与免疫印迹反应(Western-Blot)
免疫电镜技术：
免疫铁蛋白技术
技术
应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动
态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等
四、细胞内特异核酸的定位与定性
光镜水平的原位杂交技术
（同位素标记或荧光素标记的探针）
电镜水平的原位杂交技术
（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）
PCR技术
五、放射自显影技术
原理及应用：
利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行
定性、定位与半定量研究；
实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。
步骤：
前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）
———放射自显影
六．定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry） 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。
包括：
紫外光显微分光光度测定法
可见光显微分光光度测定法
流式细胞仪（Flow Cytometry）
主要应用：
用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；
测定细胞群体中不同时相细胞的数量；
从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；
分离DNA含量不同的中期染色体。
一、细胞的培养
动物细胞培养
类型：原代培养细胞（primary culture cell）
继代培养细胞（sub-culture cell）
细胞株（cell strain）正常二倍体，接触抑制
细胞系（cell line）亚二倍体，接触抑制丧失 植物细胞
类型：原生质体培养（体细胞培养）
单倍体细胞培养（花药培养）
非细胞体系（cell-free system）
二、细胞工程
细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 单克隆抗体（monoclone antibody）技术图
细胞拆合与显微操作技术
物理法结合显微操作技术(图1、图2)
化学法结合离心技术
制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。
其它技术
遗传分析（mutant, knock out, knock in）
对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈
对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈。