蛋白质的测定使用凯氏定氮法解说

甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色 灰色 甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色→灰色 甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色→蓝紫色 甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色 蓝紫色
（g/100g） ）
有效数字： 有效数字： 蛋白质含量≥1 三位有效数字 蛋白质含量 g/100 g时，结果保留三位有效数字 时 结果保留三位 蛋白质含量＜ 两位有效数字 蛋白质含量＜1 g/100 g时，结果保留两位有效数字。 时 结果保留两位有效数字。 精密度： 精密度： 在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不 得超过算术平均值的10% 得超过算术平均值的
大火加热 保持瓶中液体微沸
冷却 加20mL水 水 冷却
同时做试剂 空白试验
至蓝绿色澄清透明 继续加热0.5～ 继续加热 ～1h
思考
1、玻璃珠的作用？ 玻璃珠的作用？ 小漏斗的作用？ 2、小漏斗的作用？ 消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？ 3、消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？ 开始消化时为什么用小火？ 4、开始消化时为什么用小火？ 消化液不易澄清透明时可采用的措施？ 5、消化液不易澄清透明时可采用的措施？ 消化完成时的产物？ 6、消化完成时的产物？ 20mL水的作用 水的作用？ 7、加20mL水的作用？ 空白试验的目的？ 8、空白试验的目的？
注意： 注意： 是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。 ①含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。 是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、 ②不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等 为6.25，花生为 ，花生为5.46，大米为 ，大米为5.95，大豆及其制品为 ，大豆及其制品为5.71，小麦粉为 ， 5.70、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是 、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为 ；硬果类为5.30；牛乳 ； 及其制品为6.38。 及其制品为 。
任务二：碱法蒸馏、 任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收
子任务1： 子任务 ：仪器及试剂的准备 仪器： 仪器：
10mL
100mL 3只 只
子任务1： 子任务 ：仪器及试剂的准备
水蒸气发生器： 水蒸气发生器： 装水至2/3处 加入数粒玻璃珠， 装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基橙指示剂 2/3 玻璃珠 数滴及硫酸 ml，使水呈微红色→ 硫酸数 数滴及硫酸数ml，使水呈微红色→按上图所示搭好 装置
②样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，为防止样液 样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨 硫酸铵在碱性条件下释放出 中氨气逸出。一是加入氢氧化钠溶液要过量， 中氨气逸出。一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要水 封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程 三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽， 中要注意接头处有无松漏现象 ③加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只 加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收， 硼酸进行吸收 呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应， 呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收 氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐 氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐 。 ④冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。 收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出，若超过时可置 收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出， 40℃ 于冷水浴中使用。 于冷水浴中使用。
试剂 硫酸铜 作用
a催化作用：加速有机物的氧化分解。 催化作用：加速有机物的氧化分解。 催化作用 b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明； 消化完全的指示剂： 消化完全的指示剂 蓝绿色，澄清，透明； c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑 蒸馏时碱性反应的指示剂： 蒸馏时碱性反应的指示剂 色沉淀 提高溶液沸点， 提高溶液沸点，从而加快有机物分解 氧化作用：有机物质氧化分解为 氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2 和
2、原理 、
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾 硫酸 一同加热消化 使蛋白质分解， 加热消化， 一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫 碱化蒸馏使氨游离 后以硫酸或盐酸 酸胺。然后碱化蒸馏使氨游离， 硼酸吸收后以硫酸或 酸胺。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸 标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质 标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数， 滴定 的含量。 的含量。
蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物， 蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物， 它主要含的元素是C、 、 、 。 它主要含的元素是 、H、O、N。 一般来说，pro的平均含氮量为16/100，既一份氮相当于 一般来说， 的平均含氮量为 ， 6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。 份蛋白质， 份蛋白质 此数值称为蛋白质系数。 所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%乘上 时 将测得的总氮 乘上 乘上pro的 所以在用凯氏定氮法定量 的 换算系数K=6.25即为该物质的 即为该物质的pro含量。 含量。 换算系数 即为该物质的 含量
〖注意〗 ①加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应 室内液体颜色
加碱足量的判断： 加碱足量的判断： 足量的判断
溶液会变成深蓝色或 溶液会变成深蓝色或产生黑色沉淀 会变成深蓝色 原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成 的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化 原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化 铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑 铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑 色的氧化铜沉淀。 色的氧化铜沉淀。 如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足， 如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需 要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。 要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。
任务三： 任务三：盐酸滴定
子任务1： 子任务 ：仪器及试剂的准备 仪器： 仪器： 25mL酸式滴定管 酸式滴定管1 25mL酸式滴定管1套 试剂 HCL标准溶液 0.0500mol/L HCL标准溶液
子任务2： 子任务 ：盐酸滴定
接收瓶 以HCL标准滴定液滴定 标准滴定液滴定 灰色终点 记录V 记录 Hcl
样品（2N） H 2SO 4 + 催化剂 NaOH H BO 2HCL (NH 4 ) 2 SO 4 2NH 3 ↑ 3 3 NH 4 ) 2 B 4 O 7 （ → 结果处理 消化 蒸馏 吸收 滴定
氨基酸～ 氨基酸～HCl～N ～ 注意〗 〖注意〗
此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、 此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶 啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗 啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。 。
量筒取10.0mLNaOH溶液 量筒取10.0mLNaOH溶液 10.0mLNaOH 通蒸汽
提起玻塞使其缓慢流入反应室 加水于小玻杯防漏气 再蒸馏1min 再蒸馏1min 取下接收瓶
颜色变化时开始计时蒸馏5min 颜色变化时开始计时蒸馏5min 面离开冷凝管下端 冷凝管下端外部
移动接受瓶使液 用少量水冲洗
（1）硼酸吸收 液的颜色
（2）吸收氨气 （3）盐酸滴定 后的硼酸吸收液 终点的颜色 的颜色
〖注意〗 注意〗
①混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色, 中性溶液中 碱性溶液中呈绿色 灰色, 酸性溶液中呈红色。 中呈红色 呈灰色,在酸性溶液中呈红色。 ②酸式滴定管的正确使用
子任务2：碱化蒸馏、 子任务 ：碱化蒸馏、硼酸吸收
10.0mL硼酸溶液 100mL三角瓶 10.0mL硼酸溶液 100mL三角瓶 示剂 漏斗 10mL试样 10mL试样 入小玻杯 塞紧玻璃塞 由小玻杯流入反应室 加1～2滴混合指 准确吸取 倒 立即 少量水洗涤小 冷凝管下端插入三角瓶液面下 盖紧玻璃塞
子任务1： 子任务 ：仪器及试剂的准备
试剂： 试剂： 40%氢氧化钠 40%氢氧化钠 20%硼酸溶液 20%硼酸溶液 混合指示剂
1、1份甲基红乙醇溶液（1g/L）与5份溴甲酚绿乙醇溶液 甲基红乙醇溶液（1g/L） 溴甲酚绿乙醇溶液 1g/L） 酒红色→ （1g/L）临用时混合 酒红色→绿色 2、2份甲基红乙醇溶液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇溶液 甲基红乙醇溶液（1g/L） 亚甲基蓝乙醇溶液 1g/L） 紫红色→ （1g/L）临用时混合 紫红色→绿色
〖注意〗 注意〗 ①装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。 装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。 ②在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml以使其 在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml以使其 甲基橙指示剂数滴及硫酸 始终保持酸性，以防水中氨蒸出。 始终保持酸性，以防水中氨蒸出。
任务四、 任务四、数据记录与计算
项目名称 样品名称 内容 样品质量m/g 样品质量m/g V初 V终 /mL / mL /mL 检测日期 检验依据 1 2 3 空白
消耗的体积V1 /mL 消耗的体积V 吸取消化液体积V 吸取消化液体积V3 平均值（g/100g） 平均值（g/100g） 两次测定之差/ 两次测定之差/平均值 精密度Cy 精密度Cy g/100g） （g/100g） F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数 6.38 蛋白质含量（g/100g） 蛋白质含量（g/100g）
3、适用范围 、
国家标准第一法 适用于各种食品中蛋白质的测定
4、任务分解 、
任务一： 任务一：湿法消化 任务二： 任务二：碱法蒸馏 硼酸吸收 任务三： 任务三：盐酸滴定 任务四： 任务四：数据记录与计算
任务一： 任务一：湿法消化
子任务1： 子任务 ：仪器及试剂的准备
仪器： 仪器：
子任务1： 子任务 ：仪器及试剂的准备
项目七 食品中蛋白质及氨基 酸态氮的测定
【学习目标 学习目标】 学习目标
1、掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换 、 算。 2、掌握凯氏定氮装置的搭建技术。 、掌握凯氏定氮装置的搭建技术。 3、掌握蛋白质的测定技术。 、掌握蛋白质的测定技术。