测定核酸含量的几种方法
核酸的定量测定(定磷法)
⑨吸量管。
⑩分光光度计。
2．试剂：
以下试剂均用分析纯，溶液要用重蒸水配制。
①标准磷溶液：将分析纯磷酸二氢钾（KH2PO4）预先置于105℃烘箱烘至恒重。然后放在干燥器内使温度降到室温，精确称取0.2195克（含磷50毫克），用水溶解，定容至50毫升（含磷量为1毫克/毫升），作为贮存液置冰箱中待用。测定时，取此溶液稀释100倍，使含磷量为10微克/毫升。
五、结果与讨论：
1．绘制出标准曲线。
2．计算
RNA的含磷量为9.5%，因此可以根据磷含量计算出核酸量，即1微克RNA磷相当于10.5微克RNA。将测得的总磷量减去无机磷量即RNA磷量。如样品中含有DNA时，RNA磷量尚需减去DNA磷量，才得到RNA磷量。DNA的含磷量平均为9.9%。
3．测无机磷量：取4支离心管，于2支中各加水0.5毫升，另2支中各加0.5毫升制备的RNA溶液，然后于4支离心管中各加0.5毫升沉淀剂，摇匀，以3500转/分离心15分钟，取0.1毫升上清液，加2.9毫升水和3毫升定磷试剂，同上法比色，由标准曲线查出无机磷的微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的无机磷量。
取4支硬质玻璃试管，分成两组，分别加入1毫升上述消化后定容的样品和空白溶液，如前法进行定磷比色测定。测得的样品光密度减
去空白光密度，并从标准曲线中查出磷的微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的总磷量。
②定磷试剂3mol·L-1硫酸∶水∶2.5%钼酸铵∶10%抗坏血酸=1∶2∶1∶1（体积比）]：配制时按上述顺序加试剂。溶液配制后当天使用。正常颜色呈浅黄绿色，如呈棕黄色或深绿色不能使用，抗坏血酸溶液在冰箱放置可用1个月。
③沉淀剂：称取1克钼酸铵溶于14毫升70%过氯酸中，加386毫升水。
核酸的含量测定I——紫外吸收法
实验35 核酸的含量测定Ｉ——紫外吸收法一、 目的和要求1、 学习紫外吸收法测定核酸含量的原理。
2、掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法。
二、 实验原理DNA 和RNA 都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm 波长处。
紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的性质。
核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用ɛ（P ）表示。
ɛ（P ）为每升溶液中含有1摩尔核酸磷时的吸光度（即光密度，或光吸度）。
RNA 的ɛ（P ）260nm （pH7）为7700~7800，RNA 中磷的质量分数约为9.5%，因此每毫升溶液中含1.0μg RNA 的吸光度为0.022～0.024。
小牛胸腺DNA 钠盐的ɛ（P ）260nm （pH7）为6600，含磷的质量分数为9.2%，因此每毫升溶液中含1.0μg DNA 钠盐的吸光度为0.020。
不同形式DNA 紫外吸光度不同，因为DNA 具有双螺旋结构，当过量的酸、碱或加热使DNA 变性，则出现ɛ（P ）260nm 值升高的增色效应现象。
在核苷酸量相同的情况下，ɛ（P ）260nm 有以下关系：单核苷酸＞单链DNA ＞双链DNA 。
DNA 变性后，双螺旋结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外吸光度增加，还可根据DNA 溶液在260nm 出吸光度的变化监测DNA 变性情况。
变性ＤＮＡ复性后，ɛ（P ）260nm 值降低，称为减色效应。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。
蛋白质的吸收峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸光度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
ＲＮＡ在260nm 与280nm 处的吸光度的比值在2.0以上，DNA 在260nm 与280nm 处的吸光度的比值为1.9左右。
当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。
紫外吸收发测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3ng/L 的检测水平。
核酸定量方法及原理
核酸定量方法及原理广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于～。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （）为6 600，含磷量为%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥；DNA 的A 260/ A 280≥。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于和时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 DNA/RNA 样液，然后向甲管加入蒸馏水，向乙管加入过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A 260值。
核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
实验九紫外分光光度法测定核酸的含量
学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定
操作步骤
准备标准品、未知样品和空白对照；按照仪器操作说明调整波长、设置测量模 式；将标准品和未知样品分别放入样品池；记录吸光度值；根据标准品的标准 曲线计算未知样品的核酸含量。
02
核酸在260nm波长处有最大吸收 峰，这是核酸特有的吸收峰，可 用于核酸的定量分析。
核酸的紫外吸光度与浓度的关系
随着核酸浓度的增加，吸光度也相应 增加。
在一定浓度范围内，吸光度与核酸浓 度呈线性关系，可以用于定量分析。
核酸含量计算公式及注意事项
核酸含量计算公式：核酸浓度（μg/mL） = (A / V) / (1000 × L) × (100 / S)
其中，A为吸光度值，V为样品体积（mL），L 为光程（cm），S为核酸分子截面积 （cm²/μg）。
注意事项
实验过程中要保持光程一致，以减小 误差。
实验过程中要避免样品污染，以免影 响实验结果。
对于不同来源和性质的核酸样品，可能需要采 用不同的实验条件和标准曲线进行定量分析。
03
实验步骤
样品制备
实验结论
根据实验结果和分析，得出实验结论，总结实验的成功与不足之处， 并提出改进意见和建议。
05
实验总结
实验收获与体会
学会了使用分光光度计进行实验 操作。
认识到实验操作对结果准确性的 影响。
01
02
掌握了紫外分光光度法测定核酸 含量的原理和方法。
03
04
了解了核酸在紫外光下的吸收特 性。
核酸的定量分析方法
光
分
析
DNA
法
AO-ST体系能 量发生荧光猝 灭
DNA浓度与荧光 猝灭强度呈线性 关系
检出限 2.6× 10-7mol/L
线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L
1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移
下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
准确、分析适应性广等特点。
DNA电化学生物传感器：基本原理
电
电压
ssDNA
化
（单链DNA）
学 法
杂交反应
电流
待测溶液
（样品中与之互补 的另一条DNA）
电导
样品中DNA的结构 和含量的测定
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器
Pt电极预 处理（抛光）
ssDNA在铂 电极表面的 固定化
核酸(DNA或RNA)在中性至碱性介质中由于核苷酸上磷酸基的离 解而能以有机 离子形式存在，因此能用某些碱性染料对其加以 测定。
定
以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化
磷
法
直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷
量。
定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基
紫
都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈
紫 外
RNA的质量浓度(mg/L)＝ A260nm 稀释倍数
吸
0.024 L
收
DNA的质量浓度（mg / L) A260nm 稀释倍数
实验七 核酸的定量
成分测定
取200mg提取的核酸，加入3mol/L硫酸10ml，在沸 水浴中加热10min制成分解液并进行组分的鉴定。
1、嘌呤碱 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加 入约1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的 银化合物沉淀。
2、核糖 取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓 盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中 10min。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
二、器材与试剂
1、试剂的配制 钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸按-2.5%过
氯酸溶液]：取3.6ml 70%过氯酸和0.25g钼酸 铵溶于96.4ml蒸馏水中。 样品DNA 2、器材 容量瓶（50ml）、离心管、离心机、紫外分 光光度计。
三、操作步骤
取两支1.0ml小离心管，甲管加入0.5ml样品 和 0.5ml 蒸 馏 水 ； 乙 管 加 入 0.5ml 样 品 和 0.5ml钼酸铵-过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴 中放置15min，以3000r/min离心10min，分 别取上清液0.75ml在量筒中定容到25ml，备 用。
干扰因素
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能 吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长处，在260nm处的消光值仅为核 酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质 含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA的260nm与280nm消光值的比值在2.0以 上；DNA的260nm与280nm消光值的比值则 在1.8左右。当样品中蛋白质含量较高时比 值即下降。
2、二苯胺试剂为什么要溶于浓醋酸? 3、请分析自己的DNA样品。
三、操作 1、提取 称取干酵母粉2g于50mL三角瓶内。加
10% NaCl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴 中提取半小时。 2.分离 将上述提取液取出，用自来水冷却，分装 在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取 液与菌体残渣等分离。 3.沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯 内，并置于有冰块的250mL烧杯中冷却。待溶液冷 至10℃以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性 乙醇，随着酸性乙醇的加入，溶液的逐步下降，溶液 中白色沉淀也逐渐增加，当 pH=2.5（RNA 等电 点）时沉淀量最多（注意严格控制pH值），继续于 冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
实验四、定磷法测定核酸含量(精)
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线；
3. 测定回收率和样品总磷量。
9
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
吸取核酸样品液1ml于凯氏烧瓶中，另吸取蒸馏水 1ml做空白试验。各加入2 ml 5M硫酸。置于140160℃烘箱内消化2-4h，待溶液呈黄褐色后，取出 冷却，加入1-2滴30%过氧化氢，继续消化，到溶液 透明为止。取出冷却后加入1ml 蒸馏水，于沸水浴 中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。 然后将消化液用蒸馏水转移至100ml容量瓶中定容 到刻度。
10
消化管 RNA/mL 标准磷原液/mL dH2O/mL
1 0 0 1
2 1 0 0
3 0 1 0
5mol/L H2SO4/mL
dH2O/mL 用dH2O定容/mL
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
11
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸的定量测定
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
核酸的定量测定
紫外吸收法 核酸的凝胶电泳 定磷法 二苯胺法 地衣酚法
紫外吸收法 实验原理
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有
吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸
的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升 溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值） （表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以 计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅 速，并对被测样品无损，用量也少。
的DNA含量。
地衣酚法
二、实验原理
1. 当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成
的核糖转变成醛类，后者与3，5-二羟基甲苯
（地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成
鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大 光吸收。 2. RNA浓度在20—250μg/ml范围内，光吸收与 RNA浓度成正比。
3
0.40 2.60 3.00 0.00
4
0.60 2.40 3.00 0.00
5
0.80 2.20 3.00 0.00
6
1.00 2.00 3.00 0.00
7
0.00 2.00 3.00 1.00
8
0.00 2.00 3.00 0.00
核酸含量测定——定磷法
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
9
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
11
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
12 生物化学实验--核酸的定量分析
核酸的定量分析【目的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。
核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为660nm 。
当无机磷浓度在 2.5~25μg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
核酸浓度测定
核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。
目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。
分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。
（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。
因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33µg / ml，RNA约为40μg/ml，寡核苷酸约为35μg/ml。
如用1cm光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。
A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。
假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。
比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。
若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。
假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
实验步骤1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.0，10mmo1/L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
检测核酸的方法
检测核酸的方法
核酸检测是一种常见的生物学检测方法，它可以用来检测DNA 或RNA的存在和数量。
在医学、科研和法医领域，核酸检测被广泛应用于疾病诊断、基因分析、病毒检测等方面。
本文将介绍几种常见的核酸检测方法，包括PCR法、原位杂交法和基因芯片法。
首先，PCR法是一种常用的核酸检测方法。
它利用DNA聚合酶酶链反应（PCR）技术，通过不断复制DNA片段来扩增目标DNA的数量，从而实现对目标DNA的检测。
PCR法具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点，因此在病毒检测、基因突变分析等方面得到了广泛应用。
其次，原位杂交法是另一种常见的核酸检测方法。
它通过将标记有荧光或放射性同位素的DNA或RNA探针与待检测样品中的靶标DNA或RNA结合，然后利用显微镜或放射自显影等技术来检测目标核酸的存在和位置。
原位杂交法适用于细胞遗传学研究、病毒感染检测等领域。
最后，基因芯片法是一种高通量的核酸检测方法。
它利用微阵列芯片上固定的数千至数百万个核酸探针，可以同时对样品中的大
量核酸进行检测和分析。
基因芯片法在基因表达分析、基因型鉴定、病毒检测等领域具有广泛的应用前景。
综上所述，核酸检测是一项重要的生物学检测技术，在医学、
科研和法医领域都有着广泛的应用。
不同的核酸检测方法各有特点，选择合适的方法取决于具体的检测需求和实验条件。
希望本文介绍
的几种核酸检测方法能够为相关领域的研究人员和实验人员提供参考，促进科学研究和临床诊断的发展。
核酸含量的测定
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
9
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
12
思考题
1. 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 酸度对测定结果的影响。
13
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。
14
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
8
3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 定容溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL A660(1) 1.5 0 1.5 8（样品） 1.5 0 1.5 9（标准） 0.15 1.35 1.5
3
还原产物钼蓝在波长660nm测定 吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA 的含磷量平均为9.9%。
4
试剂
酵母RNA样品溶液：2000μg/mL
标准磷原液：含磷量为1000 μg/mL 标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取 15mL 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果 变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
核酸的定量测定-定磷法
3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为 糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
注意事项： 1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及 其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品 中DNA含量，再算出RNA含量。 2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯 醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。 PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4· 12MoO3· 2O↓(黄色)+6H2O 6H ▪ 当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再 与试剂中的其它MoO42－结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8呈兰 色，称为钼兰。
倒入容量瓶，再加水至刻度。
混匀后，吸取3.0ml置于试管中，加定磷试剂3.0ml，摇匀， 45℃保温15分钟，冷却。测其A660nm。
3、无机磷的测定 吸取样品液（2mg/1ml）1.0 ml，置于100 ml容 量瓶中，加水至刻度，摇匀后，吸取3.0 ml置于试 管中，加定试剂3.0 ml，45℃水浴保温15分钟，冷 却，测其光吸收值。
优点：简单、快速、灵敏度高（可达3μg/ml的检测水平）。 缺点： 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
几种常见的DNA、RNA含量测定方法
二、RNA含量的测定方法 2.苔黑酚法
实验仪器
分光光度计
二、RNA含量的测定方法 2.苔黑酚法
实验方法
(1)标准曲线绘制：取试管6支，按下表编号并加入试剂：
管号 试剂 1 2 3 4 5 6
一、DNA含量的测定方法 1.光密度测定法
实验仪器
分光光度计
一、DNA含量的测定方法 1.光密度测定法
实验方法
(1)取5ulDNA样品或4ulRNA样品加水到1ml (2)用1ml水做空白
(3)把样品杯放在分光光度计比色槽上，测定A260
(4)每ml中DNA浓度(mg)将是OD值的10倍，例如稀释后样品在260nm处OD 值为0.2，则原DNA或RNA样品浓度为2ug/ml （注：若样品不能达到绝对纯度也可以通过绘制标准曲线来计算样品DNA浓度）
DNA%＝
X 100
一、DNA含量的测定方法 3.二苯胺法
应用范围
仅限于对于提取的DNA不含有其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等杂质且浓 度大于50mg/l的情况下适用
一、DNA含量的测定方法 3.二苯胺法
优点： 缺点：
操作简便，有一定精确性，常用作教学性实验
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
对DNA样品纯度有一定要求，实验试剂非实验室常用试剂
2
4
1.6
4
1.2
4
0.8
4
0.4
4
0
4
60℃恒温水浴中保温1h，冷却，在595nm波长处比色 光密度值
一、DNA含量的测定方法 3.二苯胺法
实验方法
核酸的定量分析方法
其他比值法
总结词
除了染料法和酶法之外，还有一些其他的比值法用于 核酸的定量分析。
详细描述
这些方法包括荧光定量PCR法、基因芯片法、数字 PCR法等。荧光定量PCR法是一种实时定量PCR技术 ，通过在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的 积累与核酸浓度之间的线性关系来实现对核酸的定量 分析
06
基于荧光染料的方法
。
优点
简单易行，对样品预处理要求 较低，定量准确度高。
荧光光谱法
原理
荧光光谱法是通过特定波长的激发光激发核酸分子中的荧光基团，产生荧光信号，通过测量荧光信号的强度，对核酸进行定 量分析。
应用范围
该方法主要应用于低浓度核酸样品的定量分析，如基因芯片、蛋白质芯片等。
优点
灵敏度高，可实现多通道检测，特异性较强。
应用
核酸质谱法在基因突变筛查、基因表达差异分析、基因测序 等方面有广泛的应用。
基质辅助激光解吸/电离质谱
原理
基质辅助激光解吸/电离质谱是一种将样品固定在某种基质上，再用激光束照 射，使样品瞬间气化并离子化的方法。
应用
基质辅助激光解吸/电离质谱在蛋白质组学、代谢组学、生物医药等领域有广 泛的应用。
同位素标记法
原子光谱法
01
02
03
原理
原子光谱法是通过原子能 级跃迁时吸收或发射特定 波长的光，对核酸中的元 素进行定量分析。
应用范围
该方法主要应用于分析核 酸中的元素种类和含量， 如P、S等。
优点
可同时检测多种元素，灵 敏度高，精密度高。
04
基于质谱的方法
核酸质谱法
原理
核酸质谱法利用质谱技术，将核酸分子离子化并分离出不同 质量的离子，从而实现对核酸的定量分析。
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荧光光度法
即琼脂糖凝胶电泳法。 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光 结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量 ，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓 度。用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1g的 DNA。 该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标 准对照中核酸分子的长度。
优缺点：简单，快速，灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响
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注意事项
1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂
2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物
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定糖法
核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类 化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法 测定其溶液中的吸收值，在一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的 含量成正比。 1、核糖的测定 生成的绿色化合物在λ=670nm处有最大的吸收值。 2、脱氧核糖的测定 DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成ω-羟基-γ-酮戊酸 ，该化合物可与二苯胺生成兰色化合物，在λ=595nm处有最大吸收 值。 优缺点：较灵敏，但特异性较差，凡戊糖均有此反应。
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小节
根据不同情况以及实验条件选择合适的检测方法。 无论何种方法，均需保证待测样品的核酸（DNA或RNA)纯度。 根据需要设定一定的平行以及对照。
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再见
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Company Logo中所用酶和其他试剂含量的确定 为了排除核酸在实验中的干扰
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核酸含量测定的几种方法
定磷法 定糖法 紫外吸收法 荧光光度法
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定磷法
在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应 生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物—— 钼蓝 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原 剂时，测定的最适范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总磷量， 需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化 样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量 。
测定核酸含量的几种方法
命基111 10111104 朱家民
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核酸
由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一 。 核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋 白质结合形成核蛋白。 不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不 同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA） 。
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注意事项
其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽 量可能除去。
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紫外吸收法
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在 波长为250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物 理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。 在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为 50μg/ml；单链DNA或RNA为20μg/ml。可以次来计算核酸样品的 浓度。 优缺点：只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液