激光共聚焦显微镜在生物医学研究中的应用_赵启韬
激光扫描共聚焦显微镜技术在生物学中的应用
激光扫描共聚焦显微镜技术在生物学中的应用生物学是研究生命存在、发展规律和生命活动的科学。
在传统的生物学研究中，显微镜是不可或缺的工具。
然而，传统的显微镜技术受到分辨率和探测灵敏度等限制，难以观察到生物体内微小结构的细节，而激光扫描共聚焦显微镜技术则克服了传统显微镜的诸多局限，成为生物学研究领域中一种重要的高分辨率成像技术。
一、激光扫描共聚焦显微镜技术的原理激光扫描共聚焦显微镜技术（LSCM）在20世纪的80年代初由著名物理学家弗里茨·斯特鲁斯曼发明。
它是一种基于激光打激光扫描光束来扫描物体表面的成像技术。
和传统显微镜成像技术不同的是，LSCM的光源是激光器，通过激光束聚焦于少于1微米的空间范围内。
然后，激光束扫描样品表面，强制荧光物质发射荧光，荧光信号由探测器接收。
探测器会接收到被物体反射出的荧光，并产生电信号，将这些信号以频率多路复用形式送入相应通道中。
此后，扫描激光束移动至下一个位置，重复上述过程并记录。
整个过程可以将照片连续拍摄，创建三维图像。
二、 1. 细胞内环境成像激光扫描共聚焦显微镜技术在细胞内环境成像领域应用广泛。
激光扫描共聚焦显微镜技术可以穿透多个细胞层进行观察，而成像效果还能保持在细胞内的三维结构。
通过LSCM成像，可以查看细胞和细胞器的形态，了解细胞内部活动的触发机制，揭示细胞内部储量物质和分子的特征。
例如，LSCM被广泛应用于分子生物学和免疫学研究中，以观察分子间的交互以及细胞内蛋白质的定位。
2. 功能性神经元成像LSCM技术也被广泛应用于观察和研究神经元的活动。
通过LSCM技术可以实时地观察神经元的活动情况，并且能够在极短的时间范围内捕捉神经元间复杂的联系。
由于神经元在体内不断的活动，这需要实时的成像技术，LSCM正好能满足这样的需求。
3. 病原体与宿主细胞相互作用分析病原体与宿主细胞的相互作用是研究感染病患的关键问题。
通过LSCM技术，可以更深入的了解病原体与宿主细胞之间的相互作用过程，包括侵染、排异、生存和繁殖等方面。
激光共焦扫描显微镜及其在生物医学中的应用
激光共焦扫描显微镜及其在生物医学中的应用于彦华 邢 达(华南师范大学激光生命科学研究所,广州 510631)提要:本文介绍了激光共焦扫描显微镜的结构,分析了它的原理,研究了它的光学特性,并阐述了它在生物、医学上的应用,并给出了此系统的基本光学系统及其光路设计。
关键词:激光共焦扫描显微镜,分辨率,层析技术The laser confocal scanning microscope and its applications in biology and medicineYu Yanhua X ing Da(Institute of Laser Life S cience,S outh China Normal U niversity,Guangzhou 510631)Abstract:In this paper,w e introduce you the s tructure of the laser confocal scanning microscope,analyz e its principle,study its optical property and introduce its applications in biology and medi cine.The basic optical system and the design of th e optical path is also given.Key words :laser confocal scanning microscope,resolving power,chromatography1 引言在使用普通光学显微镜时,由于光的衍射极限造成的分辨率的限制与在高分辨率时显微镜的聚焦深度很小之间的矛盾一直没有解决。
自激光发明以来,激光在显微镜中的应用日益广泛,如利用激光的相干性成功的研制了全息显微镜,利用激光的单色性作为荧光激励源设计成功的激光荧光显微镜等等。
激光成像技术在生物学中的应用
激光成像技术在生物学中的应用激光成像技术已经成为了生命科学研究领域不可或缺的一种工具。
通过激光束的高强度聚焦，使得光子能够在特定区域内进行高效的相互作用，从而获得了高空间分辨率和高时间分辨率的成像结果。
本文将从激光共聚焦显微镜、光遗传学和光刺激响应等方面，来详细阐述激光成像技术在生物学中的应用和展望。
一、激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）是一种利用激光束以点扫描方式获取高质量三维光学切片图像的高级显微成像技术。
相比于普通光学显微镜，CLSM具有很高的空间分辨率，并且可以实现非侵入性的成像。
该技术具有广泛的应用价值，在生物学、神经科学以及约束条件下的材料科学研究中显示出独特的优势。
利用CLSM可以研究单细胞及多细胞生物组织的结构和功能信息。
可通过标记特殊的荧光探针来同时观测多种细胞结构、染色体结构和功能属性的变化。
此外，CLSM也可以在应用领域中发挥重大作用，例如生物医学中肿瘤组织或脑组织病理学研究、环境污染分析等。
二、光遗传学光遗传学技术是由基因工程和光学技术相结合发展而来的新兴技术，利用蓝光、绿光和红光等波长的光线来操纵生物体内的细胞和细胞组分，达到对于细胞和组织的编写、读取和擦写等分子生物学级别的操作。
这种技术已经被广泛应用于生物学中的成像和细胞学研究中。
利用光遗传学技术，我们可以通过光敏蛋白来控制细胞的蛋白合成、离子通道、细胞膜电位等结构以及组织随时间的变化过程。
这种技术可以将新的信号转换成可见光等，从而记录所有的信号变化，可以显著提高细胞和细胞组分操作的精度。
因此，光遗传学技术已经成为了神经科学和细胞学研究领域的重要技术手段之一。
三、光刺激响应光刺激响应是指通过光刺激触发和控制生物体内的留存和执行的行为。
光刺激响应技术通过光照和光控制等方式实现了对大脑和细胞的操纵，并实现了对细胞的调控。
此外，光刺激响应技术还可以用于对某些疾病的治疗，如脑神经退化疾病等。
激光共聚焦显微镜在细胞骨架研究中的应用
激光共聚焦显微镜在细胞骨架研究中的应用摘要随着生物技术研究的不断发展，对观察细胞形态所使用的仪器要求也越来越高，普通光学显微镜已经无法满足研究的需要，激光共聚焦显微镜的产生从一定程度上弥补了光学显微镜的不足。
激光共聚焦显微镜具有分辨率高、灵敏度高、放大率高等优点，使得它在形态学、分子细胞生物学，神经科学、药理学、遗传学等领域研究中成为有力工具。
本文就其在细胞骨架的研究方面做一简要综述。
关键词激光共聚焦显微镜细胞骨架Laser Scanning Confocal Microscope in the study of cell skeletonAbstract With the development of biotechnology research, instrumentation requirements for cell morphology was observed being used increasingly high, ordinary optical microscope has been unable to meet the needs of the study, the generation of laser scanning confocal microscope optical microscope to make up to some extent from the inadequate. Laser scanning confocal microscope with high resolution, high sensitivity, magnification advantages, making it a powerful tool in the research field morphology, molecular cell biology, neuroscience, pharmacology, genetics, etc.. In this paper, a brief overview of their research in the cytoskeleton.Keywords confocal microscopy cytoskeleton所谓激光共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM)与传统显微镜相比，它具有分辨率高、灵敏度高、放大率高等优点，可以在细胞水平上进行多种功能的测量和分析，得到具有三维清晰度的原色图像，而且它还可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏。
激光扫描共聚焦显微镜的基本功能及医学各领域中的应用
群保 留并且继续培养 。一种适用 于数量较 少的突变细 胞 ，转 移细胞 和杂交瘤细胞 ，即利用高能量激 光于底部带膜 的特 制 培养皿 上在 欲选 细胞周 围切割成八角带 ，而非选细胞则 因在
标 本的一定厚度 ，标本 上每一点的图像都 会受到邻近点 的衍 射 光或散射光 的干扰 ，使 图像的信噪 比降低 ，影响 了图绿的
清 晰 度 和 分 辨 率ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 利用 激 光 扫 描 束 经
量 。利用 Ｓ Ａ Ｌ类探 针可对细胞 内 ｐ Ｎ Ｆ Ｈ进行 测定。 ２ ６ 激光细胞显微外 科 手术 ：激光 扫描共 聚焦显 微 镜将 激 光作 “ 光子 刀”使 用 ，进 行 细胞 瞬 间穿 孔 ，染 色体 精 确切 割 ，细胞器烧灼 ，神经元突起 切除等一系列细胞外 科手术 ． ２． 光 陷阱技术 ：该技 术 利用激 光 的力学 效应将 一 个微 米 ７
【 中图法分 类号 】 Ｔ ７ Ｈ７
【 文献标识码 】 Ａ 功能 应用
【 文章编号】 １０ — ０ ３２ ０ ）３ ３９ ２ ０ ８ ３７ （０２０ —０６ —０
架 、结 构性蛋 白质 、ＤＮ Ａ、Ｒ ＮＡ、酶和受 体分子等细胞 内特 异结构 的 含量 、组分 及分 布进行定量 、定性 、定时及定位 测
像 是 标 本 的 光 学 横 断 面 ，克 服 了普 通 显 微 镜 图 像 模 糊 的 缺
钳 。利用光钳移 动细 胞的微小颗粒 和结 构 （ 如 色体 、细胞
器 ）进 行 细 胞 融 合 ，机 械 刺 激 及 细胞 骨 架 弹 性 测 量 等 。 ２ ８ 细 胞 膜 流 动性 测 定 ：细 胞 膜 荧 光 探 针 受 到 极 化 光 线 激 ．
共聚焦激光扫描显微镜技术在医学研究中的应用讲解
共聚焦激光扫描显微镜技术在医学研究中的应用上世纪80年代发展起来的一种先进的细胞生物学分析仪器,是一项具有划时代意义的高科技新产品,是近代生物医学图像分析仪器最重要的发展之一,有细胞“CT”之称。
它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外线或可见光激发荧光探针,从而得到组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+,pH值、膜电位等生理信号及细胞形态改变,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代较有力的研究工具。
1 基本构造与原理 CLSM是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的一种高尖设备。
其主要由计算机系统、激光发射系统、探子系统、X-Y轴台阶系统和Z轴前进马达构成。
计算机系统一般由不同型号的CLSM作相应硬件配置及相应的图像采集、分析、离子测定等软件配置。
激光器通常是氪-氩离子混合激光管,可有多个激光波长。
按工作介质不同,激光器可分为气体、固体、染料和半导体等几种。
而近年来问世的双光子激光器具有更明显的优势。
“双光子”具有更强的穿透力,更为重要的是其比普通的CLSM的激光能量低,因此对活细胞的损伤更小, 同时减少高能量激光对荧光染料的漂白效应,从而使观察活细胞的实验过程延长。
CLSM采用点光源代替传统光镜的场光源,使探测点与照明点相对于物镜焦平面是共扼的。
焦平面以外的点不会在探测点处成像,只有焦平面上的点同时聚焦于探测点和照明点,即共聚焦。
以激光做光源并对样品进行扫描,在此过程中两次聚焦,因此称为共聚焦激光扫描显微镜。
2 主要优点 . 提高了敏感性及分辨率使用荧光素交联的抗体来测定细胞内的某些特异性参数在生物医学研究中已基本普及应用,但常常受到不在同一焦平面上的荧光干扰,而造成本底较高、组织结构细节不易分辨清楚。
CLSM的分辨率高于普通光镜,同时CLSM将高敏感性的光电倍增管合为一体,并应用数字滤过功能, 使信噪比最佳化,尽可能地排除了焦点以外的荧光干扰。
激光共焦显微技术在生物学中的应用
激光共焦显微技术在生物学中的应用生物学研究是一门复杂的学科，需要运用到各种物理、化学、生物学的知识。
其中，显微镜技术作为一种非常重要的工具在生物学领域中得到了广泛的应用。
而激光共焦显微技术作为一种非常先进的显微技术，其在生物学中的应用也越来越广泛。
激光共焦显微技术是目前最先进的生物学显微技术之一，它可以在非常短的时间内对生物样本进行高分辨率成像，从而获取高质量的生物学图像。
与传统的荧光显微镜技术相比，激光共焦显微技术使用的激光光源呈现了更高的光亮度和更窄的光谱带宽，因此，它能够更精确地探测生物样本中的分子信号，从而获得更高的成像质量。
在生物学中，激光共焦显微技术的应用非常广泛，尤其是在生命科学研究中，它被广泛地运用于细胞和组织成像、功能成像、分子成像等多个方面。
在细胞成像方面，激光共焦显微技术可以非常清晰地观察到细胞内的结构和细胞器，如细胞核、高尔基体、线粒体等。
同时，激光共焦显微技术还可以提供三维立体成像，使得研究者们可以更好地观察细胞内的结构和过程，从而更好地理解细胞的功能和疾病发生的机理。
在肿瘤研究中，激光共焦显微技术还可以观察到肿瘤细胞和正常细胞的形态学和功能上的差异，从而对肿瘤疾病的研究提供了更深入的了解。
在功能成像方面，激光共焦显微技术可以观察到细胞内某些特定的功能及其相互作用，如细胞内的信号传递、代谢和分子交互，还可以检测到细胞内的离子浓度、膜电位等参数的变化，从而为生命科学研究提供了非常有价值的信息。
在分子成像方面，激光共焦显微技术可以通过结合各种荧光染料和钙指示剂等方法，实现对生物分子的表达定位和活动状态的记录。
这些信息可以用来了解某些信号通路的机理，如高尔基体中的转运机制、传递到细胞核中的信号通路等。
综上所述，激光共焦显微技术在生物学中的应用非常广泛，对于生命科学研究的发展起到了非常积极的作用。
随着技术的不断进步和发展，相信这种技术将会在生物学领域中发挥更加重要的作用，为我们更好地理解生命体系的本质和机制提供更多有价值的信息和数据。
共聚焦激光扫描显微镜在发育生物学中的应用
共聚焦激光扫描显微镜在发育生物学中的应用饶丽萍生物技术121班 12772024共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）是生物医学领域分析细胞结构和功能强有力的研究工具。
近些年来，随着相关技术的发展，共聚焦显微镜的应用在发育生物学中的使用越来越广泛（图表1）。
发育生物学领域共聚焦激光扫描显微镜常用于卵母细胞/精子/胚胎的连续光学切片,横断层成像及三维重组的研究中。
哺乳动物的配子和受精卵体积较小，需要进行整体观察。
受精后和胚胎植入前，胚胎细胞数目众多，细胞发出的荧光会干扰图像的分辨率，传统的荧光显微镜很难对胚胎进行整体观察。
CLSM则通过消除非焦平面的荧光提高分辨率，可对配子和受精卵进行整体观察，并将形态观察和功能检测结合起来。
本文论述了共聚焦激光扫描显微镜在早期胚胎发育过程中的形态学和功能学研究。
形态学研究包括：细胞骨架（微丝、微管/纺锤体）和细胞器（线粒体）的观察，功能研究包括：皮层颗粒的定位和功能、细胞凋亡。
形态和功能特征的分析对：1）检查卵母细胞、精子和胚胎正常的结构和组成，2）观察卵母细胞核的状态和发现非整倍体，3）分析参与卵母细胞成熟的细胞因子，4）评价受精卵的质量等是非常重要的。
本文主要描述CLSM在小鼠和人类配子和胚胎研究中所取得的结果。
图表1 共聚焦显微镜在生命科学领域的应用情况1、激光扫描共聚焦显微镜的原理激光扫描共聚焦显微镜是由普通荧光显微镜和共聚焦系统组成的。
扫描激光经过显微镜光学系统聚焦到目标样品上，形成微米级光斑，该光斑正置显微镜物镜焦点所在，这也是激光扫描共聚焦显微镜“共焦”的本质含义。
LSCM利用生物体自身或特定染料标记后被激光激发发出荧光，激光荧光通过显微镜的光学系统及有关光学元件，输送到光电倍增管，光学信号经进一步处理，转换成样品图像[1]。
LSCM不仅可以观察单一层面的高清晰荧光图像，还可以借助于计算机软件将各个层面的图像作三维重建，直观地观察真实的三维结构[2 3]。
共聚焦激光扫描显微术ppt课件-PPT精选文档
思考题： 1. 结合1-2个例子，简述激光共聚焦扫描显微
镜技术在生物医学中的应用。
名词解释：
1. 荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP)
2. 光笼锁（caged）化合物技术
Thanks for your attention!
红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacific
sea anemone relative Discoma Striiata 中分 离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名 为DsRed。
五、在神经生物学的应用
1.神经细胞参数测定及三维重建 • 细胞外形 • 浦肯野氏细胞及其突起的投射 • 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 • 神经骨架重组的研究
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上 反射光或荧光经目镜汇聚于探测器 探检测器前有一小孔(Pinhole)汇聚光束
2.成像保存 以电信号形式储存， 可以进行图象分析（参数、 伪彩、值等）。
3.共轭(confocal) 是指光源孔和检测针孔对 物镜焦平面是共轭的。
宽场照明显微镜和共聚焦图象比较
笼锁神经递质、调质及抗体
例：光照解笼锁 NPE-氨甲酰胆碱→血管平滑肌收缩（氨
甲酰释放） Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电
极导入法，膜片钳全细胞方式导入法
CLSM的优点
1.激光是单色光、LM观察、荧光观察 2.推进器步距达0.1um（“显微CT”） 3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰
转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内 有少量GFP阳性细胞。 (荧光+普通光相差显微镜×100倍)
激光共聚焦扫描显微镜技术简介及其应用
激光共聚焦扫描显微镜技术简介及其应用孙学俊;闫喜中;郝赤【摘要】激光共聚焦显微镜(共聚焦显微镜)是在生物学研究中最通用的荧光显微镜工具之一.它的广泛流行是因为其优越的光学切片和3维(3D)重建功能.不同于普通显微镜观测厚样本时由于被聚焦外光线干扰导致模糊图像,激光共聚焦显微镜可以从比较厚的生物样本在短期内获得清晰的光学切片.激光共聚焦显微镜所得到的一幅完全对齐的3D图像系列允许对样本在虚拟空间的任意角度观测.该技术越来越成为现代生命科学研究中必不可少的一项研究工具.本文的目的是为研究生和青年研究人员提供一些使用激光共聚焦显微镜的基础知识并对它的应用做简单的介绍.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(036)001【总页数】10页(P1-9,14)【关键词】荧光;共聚焦;显微镜;细胞影像;三维图像重组【作者】孙学俊;闫喜中;郝赤【作者单位】山西农业大学农学院,山西太谷030801;阿尔伯特大学医学院肿瘤研究所,加拿大埃德蒙顿 T6G1Z2;山西农业大学农学院,山西太谷030801;山西农业大学农学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】TH742.64★特约稿件显微镜可能是生物研究实验室中最古老的仪器之一。
100多年以来，它的基本结构并没有多大的改变。
随着各种增加图像对比度的显微镜技术的发明，比如相差显微技术( DIC , Differential Interference Contrast)、荧光显微镜技术等使显微镜成为现代科学研究中一项更必不可少的研究技术手段之一。
然而没有一项显微镜技术的比激光扫描共聚焦显微镜(共聚焦显微镜)在生物学领域应用的影响大，共聚焦显微镜能够成为生物研究中最普遍的荧光显微镜工具无疑是基于其卓越的光学切片和三维重建的能力，该技术可以方便快捷地从比较厚的生物样品获得的清晰的光学切片，而且对样品的任何可能的角度可以作进一步的观测从而获得三维图像。
激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用
激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用信息来源：本站原创更新时间：2004-8-20 15:43:00陈耀文林珏龙赖效莹梅品超2004-8-2 20:07:32 激光生物学报1998年6月第7卷第2期摘要激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器，现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。
其性能为普遍光学显微镜质的飞跃，是电子显微镜的一个补充。
本文以美国Meridian 公司的ACAS ULTIMA312为例简要介绍了激光扫描共聚显微镜系统的结构，功能和生物学应用前景。
关键词激光；共聚焦显微镜；粘附细胞分析与筛选（ACAS）The Laser Scanning Confocal Microscopy System and its Biological ApplicationsChen Yaowen ,Lin Jielong ,Lai Xiaoying ,Mei Pinchao(Shantou Uni.Med .College,Central Lab ,Shantou Guangdong 515031)Ahstract The Laser Scanning Confocal Microscopy is a new medical image analysis instrument ,which is developed in the last decade.Now it is widely applied in such fields as fluorescent quantitative measurement ,conpocal image andlyusis ,3-D reconstruction ,Kinetic signal monitioring of living cell ,cellcell communication researches ,etc .In this paper ,ACSA ULTIMA 312(Meridian Co,USA)is taken as an example to introduce the principle of confocal microscopy ,its funetions and biological applications.Key words Laser Confocal Microscopy Adherent Cell Analysis and sorting(ACSA)激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning Confocal Microscopy ，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
仪器分析3激光共聚焦显微镜在病理生物学中
基因编码蛋白质产物的亚细胞定位
• 基因编码蛋白质产物的亚细胞定位是在体 外，从亚细胞水平，根据基因产物在细胞 中的定位，从而研究其在细胞的生理活动 和病理状态下可能扮演的角色。一般而言， 定位于细胞核的基因产物多于基因的转录 调控有关，而定位于细胞浆的基因产物多 在信号转导途径中起作用。
• 洗片： 50%甲酰胺/2×SSC （3×3分钟）
•
2×SSC （3×3分钟），
•
0.1×SSC （2×3分钟）
•
4×SSC/O.1Tween洗（1×3分钟）。
• 免疫荧光显色
每片加50L荧光抗体，37 ℃孵育30分钟，
4×SSC/O.1Tween洗3次，每次2分钟。
• 染色 每片加20LDAPI（碘化丙啶）。
长期时进行转染。
• GFP质粒的除菌处理和浓度测定。 • 在2个无菌的1.5mL微量离心管中准备如下溶液： • A：将1-2gGFP质粒DNA溶解于100L无血清DMEM培养
基中。
• BB两液混合，室温下放置30分钟。 • 将细胞用2mL无血清DMEM培养基漂洗1~2遍。 • 将混合的A、B两液中加入0.8mL无血清DMEM培养基，混
丫啶橙标记方法
AO标记细胞的方法： （1）细胞涂片→固定→醋酸酸化→ AO染色5-
10min →分化→洗涤→上机； （2）活细胞标记，AO本身具有一定的跨膜能
力，直接用0.01％AO标记细胞5min后，直接 观察。
蛋白和抗体的藕联探针
偶联 探针
荧光探针激发／发射／nm FITC异硫氰基荧光素494 ／518（绿色荧光)
Oregon green488496 ／524（绿色荧光）
特性 染死细胞，对pH变化不敏感
激光扫描共聚焦显微镜及其在生物医学中的应用
自动将荧光图像与透射光图像重叠以显示荧光在形态结构
［)］ 上的精确定位 ， 可以准确检测抗原表达、 荧光原位杂交斑
"
"(!
激光共聚焦显微镜的应用模式
单一光切片模式 光切片是 "#$% 最基本的成像单元， 在水平方向对一定
点及细胞结合和杀伤的形态学特性。
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激光共聚焦显微镜在生物医学中的应用
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激光共聚焦扫描显微镜及其在生物学上的应用-
激光共聚焦扫描显微镜及其在生物研究中的应用一.激光共聚焦扫描显微镜(以下简称LSM:1.利用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察分析对象进行数字图象处理的一套观察和分析系统。
2.主要系统组成:激光源、共聚焦显微镜(正置、倒置、透射、落射、荧光、微分干涉、探测器(光电倍增管、计算机以及数字图象输出设备(显示器、彩色打印机和照片幻灯片制作设备。
二.LSM技术、原理和特点:对于一个在传统显微镜下观察的生物样品来说,其结构往往是非常复杂的,而且又互相重叠,给观察带来很大困难。
特别是在荧光显微镜观察中,由于荧光标记物质和自发荧光结构重叠,紧密合在一起,而传统落射荧光显微镜物镜不但收集来自焦平面的光线,而且还收集焦平面上下的散射光线,因此影响了光分辨率。
共聚焦成像仅检测反射自焦平面的光线部分,从而解决上述问题。
光源通过一个针孔使在焦平面上形成一个小而精细的光点,从焦平面上发射出的光线通过物镜收集,光束通过光束分离器,沿着光路返回,进入探测器,同样在进入探测器前也要通过一个针孔。
这种焦平面的几何共轭设计使来自焦平面的光点正好进入针孔会聚,而焦平面外的光束会聚于针孔板前或后,被阻挡不能通过针孔进入探测器。
探测到的就是来自焦平面的。
共聚焦显微镜的光分辨率以及Z轴上的光切厚度不但取决于光的波长,而且也决定于物镜的数值孔径和针孔的直径。
其中针孔孔径的大小与分辨率成反比。
通过精细平面光切,形成生物样品不同平面的精细图象,同时将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个三维图象。
另外,在同一平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等的动力学变化。
另外,为了适应目前生物医学研究技术的飞速发展,特别是各种荧光染料的运用,以及各种荧光蛋白家属标记的运用,多重荧光标记的生物样品观察。
现在最先进的激光共聚焦显微镜已经能够同时扫描这些多重标记的荧光标记,并加以精确的区分,同时也可以观察随时间变化,这些荧光标记由于各种生物学因素而产生的波长改变(具体见下述META技术简解,从而研究到组织和细胞内分子间的相互作用关系。
激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用
激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用实验目的与要求1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理及其在生命科学中的应用。
一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理1.普通荧光显微镜的不足使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ= λ/NA）。
但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。
Laser Scanning Confocal Microscope2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
Confocal Principle每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，那个光学横短面老是有必然厚度的，又称为光学薄片。
由于核心处的光强远大于非核心处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描能够实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。
把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加持续层次的二维图像，通过专门的运算机软件处置，能够取得样品的三维图像。
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1 韩贻仁 .分子细胞生物学 .第二版 .上海 :科学出版社 , P10 2 李楠 .激光扫描共聚焦显微术 .第一版 .北京 :人民军医出 版
社, P1 3 Storch W B.免疫荧光 基础 — 实验新 原理及 临床新 应用 .第 二
版.北京 :人民卫生出版社 , P15 (2002-04-29 收稿)
左 上 :经 Rhodamine 标记的 某抗体 ;
右上 :FITC 标记的某抗体 ; 左 下 :前 二幅 图 的 综 合图
(上海 第二医 科大学 组胚教研室赠)
图 7 共聚焦显微镜下 Cos 细胞某种膜某抗体蛋白分布图
2.3 动态观察 在同一样品平面上随时间进行连续扫描 , 就可
分析细胞结构 、内含 、和标记等动力学变化 。 目前在 这方面做得最多的是使用 LSCM 观察心肌或平滑肌 细胞内游离钙 、钠 、钾离子浓度或 pH 的动态变化 。
在光轴上共聚焦 , 以至透过标本一点的光线通过透 镜后 , 不能聚焦成一点 , 而是形成一个光斑 , 从而 使成像模糊不清 (图 2)。
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图 2 球差形成光学原理示意图 F— 理论焦点, F1 — 远轴光线焦点 , F2 — 近轴光线焦点, O — 光镜中心
所谓色差 , 是由于显微镜对不同颜色的光线具 有不同的折射率造成的 。 因为不同颜色的光具有不 同的波长 , 透镜类似于三棱镜 , 对不同颜色的光线 具有不同的折射率 。 所以光线透过透镜后 , 不同颜 色的光聚焦在不同点上 , 从而使成像模糊 , 而且像 的边缘尚带有色彩 (图 3)。
1 LSCM 的原理
1.1 普通光学显微镜的光学原理 普通光学显微镜的成像原理如图 1 所示 :
图 1 普通光镜成像原理示意图 F— 焦点, 左侧箭头代表物体, 右侧箭头代表物体, O — 光镜中心
作者单位 :山东中医药大学中医基础学院中心实验室 (250014) 作者简介 :赵启韬 (1970—), 女 , 讲师 。
【Key words】 Laser scan confocal microscope Image-analysis Immunfluorescence
0 前 言
近年来 , 激光共聚焦显微镜 (laser scan confocal microscope , LSCM)在医学和生物学研究方面的 应用越来越广泛 , 它成像清晰 、 精确 、 客观 , 大有 取代和淘汰传统的普通光学显微镜和荧光显微镜的 趋势 。因此 , 作为医学工作者 , 了解和应用这种仪 器亦是大势所趋 。
在一般人想 象中 , 似乎显微 镜的放大 倍数越
大 , 观察到的物体应该越清楚 。 然而事实不然 , 决
定显 微镜成 像清晰 度的因 素是 其分 辨力 (resolution)[ 1] 。分辨力是指显微镜能将近邻的两个质点分
辨清楚的能力 , 通常是用显微镜所能分辨清楚最近
的相邻两点间的距离来表示 , 可通过以下公式表示
LSCM 在不损伤细胞的前提下 , 对活组织 、 活 细胞进行观察和测量 , 这不仅省去了繁琐的样品前 期处理过程 (如脱水 、 脱蜡 、 染色等);而且观察 过的样品还可以继续用于其他的研究 。这种功能对
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北京生物医学工程
第 22 卷
于细胞培养 、 转 基因研究尤为 重要 。 这可以 说是 LSCM 最大的优势 (图 6)。
图 4 共聚焦技术光学原理示意图 (Zei ss 公司提供)
图 3 色差形成光学原理示意图 F— 理论焦点 , F1 —红光焦点 , F2 — 紫光焦点 , O — 光镜中心
1.2 激光共聚焦显微镜在技术上的改进 从基本原理上讲 , 共聚焦显微镜是一种现代化
的光学显微镜 , 它对普通光镜从技术上作了以下几 点改进[ 2] : 1.2.1 用激光做光源
由于综合利用了以上技术 。 可以说 LSCM 是显 微镜制作 技术 、 光电技 术 、 计算机技 术的完美结 合 , 是现代技术发展的必然产物 。
2 LSCM 在生物医学研究中的应用
目前 , 一台配置完备的 LSCM 在功能上已经完 全能够取代以往的任何一种光学显微镜 , 它相当于 多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合 , 如倒 置光学显微镜 、 紫外线显微镜 、 荧光显微镜 、 暗视 野显微镜 、 相差显微镜 (PH)、 微分干涉差显微镜 (DIC)等 , 因此被称为万能显微镜 , 通过它所得到 的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色 。 2.1 观察活细胞 、 活组织
D
=n
0.61 λ · sinα2
式中的 λ代表光源波长 (可见光的波长在 400
～ 700nm 之间), n =物镜与标本间介质的折射率 ,
α=镜口角 。 正常人眼的分辨力除以某台显微镜的
分辨力所得的值就是这台 显微镜的放大 倍数 , 即
N =D 人眼 D 显微镜 。正常人眼的分辨力为 2mm ,
它对普通光镜做了多方面的技术改进 :用激光做光源 并采用 了共聚焦 技术消 除了透 镜的色 差和球 差 ;运用点 扫
描技 术 , 使标 本上每一点的图像避免了相邻点的衍 射光和 散射光 的干扰 ;结 果用计 算机处 理 ;因而其 图像高 度
清晰且数字化 。激光共 聚焦显微镜不仅可以观察 活细胞 、 活组织的 动态代 谢过程 , 而且可 以获得三 维图像 , 与
2.4 数据 、 图像的数字化 用计算机代替了普通的照相机 , 得到的图像是
数字化的 , 可及时输出或长期储存 , 而且还可进一 步加工处理 。 2.5 定量测量
首先应用专一的荧光探针对样品进行染色 , 样 品的荧光强度和所测成分的含量呈正比 , 如果其余 条件固定 , 通过对比各组样品之间的荧光强度值 , 可得出特定成分的含量比 (图 8)。
其他的生物学技术相配合 , 几乎可定性 、 定量定位地检测组织细胞内的任何一种生化成分 。
关键词 激光共聚焦显微镜 图像分析 免疫荧光
中图分类号 R312
文献标识码 A
文章编号 1002-3208 (2003) 01-0052-03
Application of Laser Scan Confocal Microscope in Bio-Medical Fields ZHAO Qitao , MIAO J unying . The Central Laboratory of Traditional Chinese Medicine College , Shandong University of Traditional Chinese Medicine , Jinan 250014
根据理论计算, 光学显微镜的分辨力可以达到
0.2μm , 或者说放大倍数可以达到 光镜放大倍数也仅有几百倍 。
光学显微镜的实际分辨力要受到一些物理因素
和透镜质量的影响 , 主要是受球差和色差的影响 。
所谓球差 , 是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线
第 1期
激光共聚焦显微镜在生物 医学研究中的应用
左上 :经 Rhodamine 标 记的 死菌 ;
右 上 :经 FITC 标 记 的 活 菌;
左下 :前 二幅 图的综 合图 . (上海第 二医科 大学 组胚教研室提供)
图 8 共聚焦显微镜下雪链菌
3 结束语
通过上述介绍 , 共聚焦显微镜强大的功能已可 见一斑 。 与其他的生物学技术 (如免疫组化技术 、 原位杂交技术等)相配合 , 它的检测范围进一步扩 大 。目前市场上出售的荧光探针已近 2000 余种[ 3] , 这就使我们几乎可利用共聚焦显微镜定性 、 定量地 检测细胞内的任何一种生化成分 。因此共聚焦显微 镜越来越成为生物医学研究人员的得力助手 , 随着 时间的推移 , 相信它的应用会更加普及 。
图 6 共聚焦显微镜下培养大鼠细胞图
左上 左下
:经 Rhodamine 标记的某抗体 :透射光下细胞图
; 右 右上 下
:FITC 标记的某抗体 :前三幅图的综合图
2.2 生化成分精确定位观察 配合专用的分子探针 , 对于要检测的成分不仅
可以定位到细胞水平 , 还可以定位到亚细胞水平和 分子水平 (图 7)。
【Abstract】 Laser S can Confocal M icroscope (LSCM)is a modern opti cal mi croscope .It is a product that integrates microscope manufacturing technology , optical-electronic technology, and computer technology .Compared with normal microscope , there are a lot of improvement s.Because its light source is a laser tube, color aberration of lens and spheri cal aberration of lens were eliminated .The use of point scanning technology resulted in that , for every pixel of the image of the sample diffraction and dispersion of neighboring pixel was avoided .Results thus obtained were processed with computer, so the images were digital and very sharp .With the LSM , not only the dynamic metabolism process of live cells and tissues can be observed, but also three dimensional images can be obtained.Moreover, i n combination with other biological technologies , almost every biochemical i ngredient can be detected and measured in quantity and quality.