高效液相色谱法HPLC-生物在线
107653-生物药物分析与检验-第五章 高效液相法
流动相过滤器样品过滤器 Nhomakorabea6.2 分析方法的设定
流动相的配比及流量------选择何种有机相， 纯水或缓冲溶液，有机相与水相的比例，流动相 的总流量。
紫外检测波长的确定------通过测定被分析样 品的最大吸收波长（紫外吸收检测器）。
是否采用梯度洗脱，确定起始配比（如 20∶80)及终点配比(如80∶20)。
样品分析方法介绍
1 流动相及样品的准备
1，流动相的准备 流动相的选择------有机相（甲醇、乙腈）与水
（去离子水、缓冲溶液） 流动相的过滤------用孔径为0.45μm滤膜过滤
除去固体颗粒杂质。 流动相的脱气------超声脱气、吹氦脱气、加热
回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。 2，样品的准备
液相色谱分析
分析方法建立的实例
梯度方法开发实例 - 第七步
最后用50-90%B，得到好的结果。
思考题
• HPLC仪器由哪几部分构成？简述各部分的主 要功能，并指出哪一部件对分离效果影响最大。
• 正相HPLC与反相HPLC的主要不同之处什么？ 各适合分离什么物质？
• 液相色谱中最常用的检测器是什么检测器，它 适合那些物质的检测？
样品的分析
1, 选定分析条件，走基线； 2, 待基线平稳后，发出进样指令； 3, 用进样针吸取已过滤好的定量样品； 4, 进样分析，获得色谱图及分析结果； 5, 如谱图效果不佳，则改变条件后继续分析。
• 操作中常见问题及解决方案见P97
HPLC的应用
• 在食品研究中的分析应用
• 保留时间，tR － Retention time
– 组分从进样到出现峰最大值所需的时间
• 保留体积，VR － Retention volume
高效液相色谱仪的四种检测方法及计算
高效液相色谱仪的四种检测方法及计算高效液相色谱仪（HPLC）在化学、生物学、制药、食品等领域都有广泛应用，其检测方法多种多样，以下将详细介绍四种常用的检测方法及其计算方式。
一、紫外-可见光检测法 (UV-Vis)紫外-可见光检测法是最常用的HPLC检测方法。
在此方法中，样品组分在紫外或可见光区域有吸收，因此可以被检测。
计算方法一般采用峰面积或峰高法定量。
峰面积法比峰高法更为准确，因为它同时考虑了峰的高度和宽度。
在计算时，首先需要获得标准品的校正曲线，然后根据未知样品的峰面积或峰高在校正曲线上找到对应的浓度。
二、荧光检测法 (Fluorescence)荧光检测法的灵敏度通常比紫外-可见光检测法更高，但并非所有化合物都能产生荧光。
在这种方法中，样品组分被激发光照射后发出荧光，荧光强度与组分浓度成正比。
计算方式与紫外-可见光检测法类似，也是通过校正曲线进行定量。
三、电化学检测法 (Electrochemical Detection)电化学检测法通常用于检测具有电化学活性的化合物，如许多药物和神经递质。
它可以在没有光学性质的情况下对物质进行检测，提高了HPLC的应用范围。
常见的电化学检测方法包括安培检测法和电导检测法。
定量计算通常基于法拉第定律，即电流与通过电解池的电荷量成正比。
四、质谱检测法 (Mass Spectrometry)质谱检测法是与HPLC连用的一种高级检测方法，可以提供待测物质的分子量信息，从而确定其化学结构。
在此方法中，HPLC分离后的组分直接进入质谱仪进行检测。
定量计算通常使用内标法或外标法，需要对待测物质进行同位素标记或使用已知量的内标物质。
此外，还可以使用多反应监测模式（MRM）进行更准确的定量。
以上四种方法各有优缺点，应根据具体的应用需求和样品性质选择合适的方法进行检测和计算。
同时，为了获得准确可靠的结果，还需要对HPLC系统进行适当的维护和校准。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
hplc高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法
第十五章高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，HPLC 15.1概述高效液相色谱又称为高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquid Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquid Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquid Chromatography），是在20世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术。
由于其适用范围广，分离速度快，灵敏度高，色谱柱可以反复使用，样品用量少，还可以收集被分离的组分，特别是计算机等新技术的引入使其自动化与数据处理能力大大提高，高效液相色谱技术得到飞速发展。
高效液相色谱法和经典液相色谱法在分析原理上基本相同，但由于在技术上采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。
经过数十年的发展，高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化等方面，都达到了很高的程度，可以和气相色谱法相媲美，并保持了经典液相色谱对样品通用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。
至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品行业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。
15.1.1与经典液相色谱法比较经典液相色谱法通常使用的固定相是多孔粗粒，装填在大口径长色谱柱（玻璃）管内，流动相是靠重力作用流经色谱柱的，溶质在固定相的传质速度缓慢，柱入口压力低，分析时间长，因此柱效低，分离能力差，难以解决复杂混合物的分离分析；而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相是通过高压输液泵进入色谱柱的，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，柱效可比前者高2~3个数量级，从而在短时间内获得高柱效和高分离能力，可以分离上百个组分。
高效液相色谱分析法概述
高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。
经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。
新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。
高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。
近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。
（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。
（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。
如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。
（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。
高效液相色谱分类及工作原理
阳离子交换： 阳离子交换：
R
SO3 H
- +
+
M
+
R
SO3-M+
+ H+
阴离子交换：
R
NR3+Cl-
+
X
-
R
NR3+X-
+ Cl-
一般形式：
R一A＋B ＝ R－B＋A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（ 达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应 的选择系数）： 的选择系数）：
KB / A
[B]r [ A] = [B][ A]r
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,有 达平衡时 有
Kad
[ X ad ][S] = n [ X ][Sad ]
n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂 为吸附平衡常数， 其中 为吸附平衡常数 上保留强，难于洗脱。 值小,则保留值弱 上保留强，难于洗脱。Kad值小 则保留值弱，易 值小 则保留值弱， 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通 值可通 过吸附等温线数据求出。 过吸附等温线数据求出。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅， 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 渗透性好，装柱容易， 渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平 较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受限制。 最大允许量受限制。
柱之内径
长度
填充材料粒度
使用压力
分离时间
㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点 与气相色谱法比较， 的优点
HPLC
高效液相色谱法
2 仪器组成 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、 色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
高效液相色谱法
泵
洗脱分等度洗脱和梯度洗脱二种。梯 度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀实 现程序控制。
高效液相色谱法
进样器 手动进样器(六通阀式进样器) 自动进样器：在程序控制器或微机控制下， 可自动进行取样、进样、清洗等一系列动 作，有几种比较典型的自动进样装置：圆 盘式自动进样器、链式自动进样器、坐标 式自动进样器等，操作者只需将样品按顺 序装入贮样室内即可。
高效液相色谱法
④包覆聚合物(Polymer encapsulated) 包覆聚合物是在无机载体如硅胶、石墨化 碳或氧化锆的表面形成固载化的有机聚合 物薄层，聚合物薄层表面还可键合上C18、 C8、NH2、CN等，色谱过程中仅聚合物层 与流动相和组分接触，因而兼顾了无机载 体的刚性和有机聚合物的化学稳定性。
高效液相色谱法
3、电化学检测器(Electrochemical detector，ECD)： 电化学检测器是测量物质的电信号变化，对具 有氧化还原性质的化合物，如含硝基、氨基等有机 化合物及无机阴、阳离子等物质可采用电化学检测 器。包括极谱、库仑、安培和电导检测器等。前三 种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质的化 合物的检测，电导检测器主要用于离子检测。其中 安培检测器(amperometric detector，AD)应用较广泛， 更以脉冲式安培检测器最为常用。
高效液相色谱法
缺点：只适用于能够产生荧光的物质 的检测，适用范围不如紫外检测器。影响 因素较多，对溶剂的纯度、pH值、样品浓 度、检测温度等需很好地控制。 适用范围：具有天然荧光的物质可以 直接检测，也可通过荧光衍生化使原本没 有荧光的物质转变成荧光衍生物后测定， 从而扩大了荧光检测器的适用范围。主要 用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化 合物及酶等的检测。
高效液相色谱测定法
高效液相色谱测定法
高效液相色谱测定法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和定量技术，可
以用于分离和测定复杂的混合物。
它基于物质在流动相（溶剂）和固定相（色谱柱上的填料）之间的相互作用的差异，利用流动相的流动将待测样品分离成不同的组分。
通过分析组分的保留时间和色谱峰的峰面积或峰高，可以定量不同组分的含量或浓度。
高效液相色谱测定法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，因此在许多分析领域得到广泛应用。
它可以应用于生物医药、环境监测、食品安全等多个领域，用于分析和监测有机化合物、无机化合物、药物、天然产物、食品成分等。
高效液相色谱测定法的基本步骤包括：样品预处理、制备流动相、样品进样、流动相流动、色谱柱分离、检测器检测、结果处理等。
根据样品的性质和分析要求，可以选择不同的检测器，如紫外检测器（UV）、荧光检测器、质谱检测器等。
需要注意的是，高效液相色谱测定法在操作过程中需要注意样品制备和仪器条件的优化，以提高分离效果和分析结果的准确性。
此外，也需要注意流动相成分的选择、色谱柱的使用寿命等因素对分离效果的影响。
第五章高效液相色谱法
9
基本理论
热力学理论：塔板理论——平衡理论 热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论—— 范第姆特 动力学理论：速率理论 ——范第姆特 方程 色谱图的基本参数：与气相色谱法类 似
10
各类高效液相色谱法的分离原理及选 择
液-固吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
3
高效液相色谱法的类型
根据固定相的不同 液-固色谱 液-液色谱 根据分离机理的不同 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱
4
分配色谱：分离组分在两相中的分配系数不 同 吸附色谱：固定相对分离组分的吸附能力不 同 离子交换色谱：不同离子与固定相上的相反 电荷离子间作用力大小不同 体积排阻色谱：根据样品分子尺寸的不同按 分子大小分开 亲和色谱：不同基体上键合多种不同特性的 配位体作固定相，用具有不同pH的缓冲溶液 做流动相，依据生物分子与基体上键联的配 位体之间存在的特异性亲和作用力不同
30
流动相
1. 流动相特性
(1)液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂 液相色谱的流动相又称为：淋洗液， 液相色谱的流动相又称为 。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分 流动相组成改变，极性改变， 分离状况； 分离状况； (2)亲水性固定液常采用疏水性流动相 ， 即流 亲水性固定液常采用疏水性流动相， 亲水性固定液常采用疏水性流动相 动相的极性小于固定相的极性， 动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色 谱法，极性柱也称正相柱。 谱法，极性柱也称正相柱。 (3)若流动相的极性大于固定液的极性 ， 则称 若流动相的极性大于固定液的极性， 若流动相的极性大于固定液的极性 为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。 为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分 31 在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
简述高效液相色谱法用于杂质检测的几种方法及其适用条件
简述高效液相色谱法用于杂质检测的几种方法及其适用条件高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于药品、食品、生物制品等领域的分析技术，其灵敏度高、分离效果好、检测速度快、操作简便等优点，使其成为杂质检测的重要手段。
本文将介绍HPLC用于杂质检测的几种方法及其适用条件。
一、正相色谱法正相色谱法是指使用亲水性固定相，亲油性流动相的色谱技术。
对于药品的杂质检测，正相色谱法一般用于检测药物的不纯物、副产物及其降解产物等，如溶质的极性较大，适合使用正相色谱法。
1.逆流萃取法逆流萃取法是利用化学诱导物质通过反应生成或转化为更为极性或亲水性的产物，并用亲水性溶剂逆流提取，将产物与样品基质分离的方法。
逆流萃取法主要适用于水溶性杂质的检测，其操作简便，能进行选择性萃取，具有较高的检测灵敏度和准确性。
2. 核糖核酸碱解法核糖核酸碱解法是利用碱性溶液，使DNA或RNA被碱解后，经过脱色和加热处理，产生大量的碎片，然后通过正相色谱分离，进一步鉴定和定量其中的各种碎片的分子量，得到杂质含量的结果。
该方法适用于生物制品的杂质检测，如疫苗、血清等生物制品中杂质检测。
二、反相色谱法反相色谱法是指固定相为亲油性材料，流动相为亲水性的溶剂。
反相色谱法适用于一些不太易发生氢键或金属络合的化合物，也可以用于检测药品中的有机杂质、无机杂质等。
1.基线漂移法基线漂移法是指在反相色谱法中，属性相同杂质会相同时，只能通过基线漂移来判断其是否存在，并推断其相对含量的方法。
该方法适用于检测大分子药品或高分子物质中的杂质，如蛋白质、多肽、核苷酸等。
2. 静电耦合检测器法静电耦合检测器法是利用静电作用力，将电极上的杂质快速扫过，通过检测器采集下来，进行检测的方法。
该方法适用于分子量大于1000Da的高分子物质的检测。
该方法具有快速、高灵敏度、稳定性好的优点，因此在高分子物质中的杂质检测方面得到广泛应用。
三、离子交换色谱法离子交换色谱法是指利用正负离子之间的吸引和排斥作用，将目标化合物分离出来的一种技术。
《环境仪器分析》第九章 高效液相色谱法
2019/10/31
东华大学Hale Waihona Puke 相表面存在的某种特异性亲和
力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种
具有一般反应性能的所谓间隔
臂(环氧、联胺等)，再连接上配
基(酶、抗原等)，这种固载化的
配基将只能和具有亲和力特性
吸附的生物大分子作用而被保
留，没有这种作用的分子不被保留。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinitychromatograph）
定相上的吸附作用不同来进行分离。 固 定 相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、硅
-镁吸附剂等，较常使用的是5～10μ m的硅胶吸附剂。 在高效液相色谱法中，表面多孔型或全多孔型都可作吸附色谱
中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小、孔穴浅等优点，能极 大提高柱效。
但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多 孔型微粒填料。
• 选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、 甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等。
• 分离对象：以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品， 以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定
（2）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力， 即不产生作用力，仅起到载气作用。而HPLC流动相可选用不 同极性的液体，对组分产生作用力，流动相对分离起很大作用。
高效液相色谱法HPLC
五、高效液相色谱法的主要类型及原理
1、液-液分配色谱 2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱 4、离子对色谱 5、离子色谱 6、排阻色谱 7、亲和色谱(AC)
1、液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反 之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase ）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。
5、离子色谱
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方 法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。 例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电 导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高 背景电导信号掩没而无法检测。
为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时 测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱 后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交 换树脂。
举例：
苯乙胺类药物中重酒石酸去甲肾上腺素注射液 的高效液相色谱测定法。
色谱条件与系统适应性试验：十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂；以0.14%更烷基磺酸钠溶液— —甲醇(65:35)，用磷酸调节PH值至3.0作为流动 相；流速为每分钟1ml；检测波长为280nm。理论 板数按重酒石酸去甲肾上腺素峰值计算应不低于 3000。
3、废液流入废液瓶。 遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可 用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温 类似，不同的是气相色谱改变温度，
高效液相色谱分析法
现代食品检测技术第一部分——色谱分析——高效液相色谱第七章高效液相色谱分析法High performance liquid chromatograph 第一节高效液相色谱的特点与仪器第二节主要分离类型与原理第三节液相色谱的固定相与流动相第四节影响分离的因素与操作条件的选择第五节新型液相色谱简介2010-1-25第一节高效液相色谱的特点与仪器2010-1-25一、高效液相色谱法的特点在经典的液体柱色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论。
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。
高效液相色谱法的突出特点：1）高效（柱效约为30000n /米）2）高速（较经典色谱法））3）高压（150 -350*105Pa4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光：10-11g ）2010-1-251. HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1）经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1～3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀；常压输送流动相，柱效低（H↑，n↓）；分析周期长、无法在线检测。
2）HPLC：分离和分析柱内径2～6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）；高压泵输送流动相，柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩短、可以在线检测。
2010-1-252. HPLC与GC差别9相同：兼有分离和分析功能，均可以在线检测9主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别1）分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，仅能分析有机物的20％。
HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80％。
2010-1-252）流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3）操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大）2010-1-25二、液相色谱仪器2010-1-25三、流程及主要部件Process and main assembly of HPLC 1.流程2010-1-252.主要部件(1) 高压输液泵♥主要部件之一，压力：150～350×105Pa。
第二十章高效液相色谱法
φ A , φB
—每个溶剂体积分数。
例如：如何用水和乙腈配制 P ' 值为6.9二元溶剂？
' ' ' 已知： PH2O 10.2; PACN 5.8; PIPA 3.9.
' ' ' 解： PAB φ A PA φB PB ' ' φH2O PH2O φ ACN PACN ' ' φH2O PH2O (1 φH2O )PACN
φH2O 10.2 (1 φH2O ) 5.8 6.9 φH2O 0.25
水：乙腈=25：75
3. 溶剂强度参数（表20-1）
（2）溶剂强度参数 ε
*
定义：溶剂分子在单位吸附剂表面的吸附能。
ε* 2 0.8ε* 2O3 SiO Al
使用于吸附色谱或正相色谱
3. 溶剂强度参数（表20-1）
2. 进样系统
1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简 单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进 样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，
如图。
装入样品 采样环 进样
进色谱柱 泵入溶剂 出口
3. 分离系统（色谱柱）
1）柱材料：
常用内壁（抛光）光滑的优质不锈钢柱，使用前
三. 应用
由于HPLC分离分析的高 灵 敏 度 、 定量 的 准 确 性 、
适 于 非挥发性 和 热不稳定
组 分 的 分 析， 因 此 ， 在工 业 、 科 学 研究 ， 尤 其 是在 生 物 学 和 医学 等 方 面 应用 极 为 广 泛 。如 氨 基 酸 、蛋 白 质 、 核 酸、 烃 、 碳 水化 合 物 、 药 品、 多 糖 、 高聚
高效液相色谱法
液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相
（四） 亲和色谱固定相
亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
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流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
目
录
一、液相色谱分析法的发展 二、液相色谱分析法的特点 三、高效液相色谱分析法的应用 七、分离数据的处理方法 八、参考文献
一、液相色谱分析法的发展
• 20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。 经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色 谱。 • 20世纪60年代末： 随着色谱理论的发展、高效细微固定相的 开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用， 高效液相色谱法得到了突破性的发展。
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 • • 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固
定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
分配系数：物质在两相溶剂中分配平衡时的比例
分配系数：1
举例：
苯乙胺类药物中重酒石酸去甲肾上腺素注射液 的高效液相色谱测定法。
色谱条件与系统适应性试验：十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂；以0.14%更烷基磺酸钠溶液— —甲醇(65:35)，用磷酸调节PH值至3.0作为流动 相；流速为每分钟1ml；检测波长为280nm。理论 板数按重酒石酸去甲肾上腺素峰值计算应不低于 3000。
类比
液柱色谱法和跑道赛跑
二、液相色谱分析法的特点
在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、 分离效率高和操作自动化。
兼具分离和分析功能，可以在线检测。
• 高效液相色谱法的突出特点：
1）高压（150－350*105Pa）
2）高速
3）高效
4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外 10-9g，荧光 10-11g ）
2、液-固吸附色谱
基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。
特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性；
缺点：非线形等温吸附，常引起峰的拖尾
3、离子交换色谱
基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分 与离子交换树脂（固定相）之间亲和力的大小与离子半径、 电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H +
阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
高效液相色谱法 （HPLC）
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。 • 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
五、高效液相色谱法的主要类型及原理
1、液-液分配色谱
2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱 4、离子对色谱 5、离子色谱 6、排阻色谱 7、亲和色谱(AC)
1、液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反 之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase ）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。
苯巴比妥、苯妥英和卡马西平均为临 床上常用的抗癫痫药，其药物浓度与疗效 和毒副反应密切相关。临床上常将三种药 物同时使用，为提高疗效，减少毒副作用 与个体差异，为超剂量中毒诊断、治疗与 及时调整给药方案提供科学依据，临床上 要进行血药浓度检测，而高效液相色谱法 是最常用的方法之一。
乙腈(jīng)又名甲基氰，分子式 CH3CN，无色透明液体，密度小于水， 约为0.79，能与水、乙醇等有机溶剂以 任意比混溶，易燃，有毒性。
流动相 固定相
64 16 32 8 0 32 16 8
0 32 16 16 0
分配系数：3
0 16 8 0 8
流动相 固定相
3 1
18 6
27 9
操作过程图示
四、液相色谱分析法的原理
• 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决 于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和 力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分 离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运 动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的 扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以 及流动相的流速等有关。 • 所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面 的综合效益。
三、液相色谱仪（1）
三、液相色谱仪（2）
四、液相色谱分析法的原理
• （一）高效液相色谱分析的流程 1、由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后 输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。 2、被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱， 在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理 设备采集与处理，并记录色谱图。 3、废液流入废液瓶。 遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可 用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温 类似，不同的是气相色谱改变温度， 而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分 在最佳条件下得以分离。
反相高效液相色谱法
即指流动相的极性大于固定相极性的色 谱方法。在本法中常采用化学键合相作为固 定相，流动相采用水——甲醇或水——乙腈 系统，在反相色谱中，极性强的组分在分离 时先流出柱子，极性弱的组分后流出。因此 适合于共存组分极性差异较大的样品分析。 如高效液相色谱测定硫酸阿托品片的含量。
举例：巴比妥类药物