高效液相色谱法HPLC-生物在线

类比
液柱色谱法和跑道赛跑
二、液相色谱分析法的特点
在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、 分离效率高和操作自动化。
兼具分离和分析功能，可以在线检测。
• 高效液相色谱法的突出特点：
1）高压（150－350*105Pa）
2）高速
3）高效
4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外 10-9g，荧光 10-11g ）
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 • • 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固
定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
分配系数：物质在两相溶剂中分配平衡时的比例
分配系数：1
三、液相色谱仪（1）
三、液相色谱仪（2）
四、液相色谱分析法的原理
• （一）高效液相色谱分析的流程 1、由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后 输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。 2、被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱， 在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理 设备采集与处理，并记录色谱图。 3、废液流入废液瓶。 遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可 用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温 类似，不同的是气相色谱改变温度， 而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分 在最佳条件下得以分离。
苯巴比妥、苯妥英和卡马西平均为临 床上常用的抗癫痫药，其药物浓度与疗效 和毒副反应密切相关。临床上常将三种药 物同时使用，为提高疗效，减少毒副作用 与个体差异，为超剂量中毒诊断、治疗与 及时调整给药方案提供科学依据，临床上 要进行血药浓度检测，而高效液相色谱法 是最常用的方法之一。
乙腈(jīng)又名甲基氰，分子式 CH3CN，无色透明液体，密度小于水， 约为0.79，能与水、乙醇等有机溶剂以 任意比混溶，易燃，有毒性。
目
录
一、液相色谱分析法的发展 二、液相色谱分析法的特点 三、液相色谱仪 四、液相色谱分析法的原理 五、高效液相色谱法的主要类型及原理 六、高效液相色谱分析法的应用 七、分离数据的处理方法 八、参考文献
一、液相色谱分析法的发展
• 20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。 经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色 谱。 • 20世纪60年代末： 随着色谱理论的发展、高效细微固定相的 开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用， 高效液相色谱法得到了突破性的发展。
3、离子交换色谱
基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分 与离子交换树脂（固定相）之间亲和力的大小与离子半径、 电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H +
阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
高效液相色谱法 （HPLC）
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。 • 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
举例：
苯乙胺类药物中重酒石酸去甲肾上腺素注射液 的高效液相色谱测定法。
色谱条件与系统适应性试验：十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂；以0.14%更烷基磺酸钠溶液— —甲醇(65:35)，用磷酸调节PH值至3.0作为流动 相；流速为每分钟1ml；检测波长为280nm。理论 板数按重酒石酸去甲肾上腺素峰值计算应不低于 3000。
反相高效液相色谱法
即指流动相的极性大于固定相极性的色 谱方法。在本法中常采用化学键合相作为固 定相，流动相采用水——甲醇或水——乙腈 系统，在反相色谱中，极性强的组分在分离 时先流出柱子，极性弱的组分后流出。因此 适合于共存组分极性差异较大的样品分析。 如高效液相色谱测定硫酸阿托品片的含量。
举例：巴比妥类药物
2、液-固吸附色谱
基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。
特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性；
缺点：非线形等温吸附，常引起峰的拖尾
五、高效液相色谱法的主要类型及原理
1、液-液分配色谱
2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱 4、离子对色谱 5、离子色谱 6、排阻色谱 7、亲和色谱(AC)
1、液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反 之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase ）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。
流动相 固定相
64 16 32 8 0 32 16 8
0 32 16 16 0
分配系数：3
0 16 8 0 8
流动相 固定相
3 1
18 6
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操作过程图示
四、液相色谱分析法的原理
• 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决 于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和 力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分 离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运 动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的 扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以 及流动相的流速等有关。 • 所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面 的综合效益。