表达产物的分离纯化
毕赤酵母表达风味强化肽的分离与纯化
２ ０ ．将 硫 酸 铵 烘 干 研 细 ， 质 量 分 数 为 ３ ％、 ０ ｍＬ 按 ０ ３ ％、 ０ ４ ％、 ０ ５ ４ ％、 ５ ５ ％和 ５ ％向发 酵 上 清 液 中缓 慢 加 ５
１ ６ １ １
５ ％沉淀蛋 白电泳 ；７ １．质量分数 ３ ％、３ ％、４ ％、４ ％、 ５ — ２ Ｏ ５ ０ ５
４ ４
入 硫 酸铵 ， 断 搅 拌 至 完全 溶 解 ， 不 ４℃ 静 置 ２ｈ，
Ｊ
６ ２ ５ ５ ５
４
５ ０、５ ％上清蛋 白电泳 （０ ５ ／
×
×
× ×
×
Ｏ
× ×
０ ０
６０ ０ｒ ｎ ４℃离 心 ２ ０ ｍｉ 、 ／ ０ｍｉ ， 淀溶 于蒸 馏 水 中 ， ｎ沉 透
（ ｙＬ ｂ ｒｔｒ ｆ ｏ ｄＮｕｒ ｉ ｎ ａｅ ， ｎｓ ｙｏ ｄ ｃ ｔ ｎ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｏ ｄＥ ｇ ｅ ｒ ｇａ ｄＢ ｏｅ ｈ ｏｏ ｙ Ｋｅ ａ ｏａ ｙｏ ｏ ｔ ｔ ｎａ ｄＳ ｆ ｙ Ｍｉｉ ｒ ｆ ｕ ａｉ ， ｏｌ ｅ ｏ ｎ ｉ ｅｉ ｎ ｉｔ ｎ ｌｇ ｏ Ｆ ｉｏ ｔ ｔ Ｅ ｏ ｅ ｏＦ ｎ ｎ ｃ
Ｓｅ ｒ ｔｏ ａ ｄ ｐａ ａ ｉｎ ｎ Ｐｕｒｆｃ ｔｏ ｏ ａ ｏ ｉ ａ ｉｎ ｆＦｌ ｖ ｒＥｎｈａ ｉ ｐ ｉ ｉ ｎｃｎｇＰｅ ｔｄｅ
ｆ ｏ ｃ ａ Ｐｃ ｔ ｒ ｓ ｒ ｍ Ｐｉｈｉ ‘ ｏ ｉ ｓ
Ｔ Ａ Ｘ ｅ ＨＡ ａ —ｈ ，Ｂ Ｉ ｉｏ ｉ，ＷＡ ａ —ｉ Ｉ Ｎ ｕ ，Ｚ ＮＧ Ｂ ｏｃ ｉ Ａ ａ －ａ Ｘ ｊ ＮＧ Ｙ ｎｐｎ ｇ
随着分 子 生物 学 的发展 和 应用 ， 百种 外 源蛋 自 数
换树 脂分 离方 法 和两 步分 离法进 行 分离 纯化 ， 寻找
蛋白质的表达纯化
06
蛋白质的表达与纯化的挑战与 展望
高表达量和高纯度蛋白质的获得
表达量
优化基因克隆、宿主菌选择和培养条件，以提高蛋白质的表达量。
操作条件
操作过程中需要注意pH值、离子强度等参数的调节，以适 应不同蛋白质的分离需求。
亲和色谱法
1 2
原理
亲和色谱法利用生物分子之间的特异性亲和力进 行分离，如抗原-抗体、酶-底物等。
常用亲和剂
常用的亲和剂包括酶的抑制剂、免疫球蛋白、生 物素等。
3
操作条件
操作过程中需要注意亲和剂的再生和循环使用， 以提高分离效率。
生物学活性检测
通过生物学实验检测蛋白质的生物学活性，如酶活性、配体结合能 力等。
04
蛋白质的表达与纯化的影响因 素
基因的拷贝数和启动子强度
基因拷贝数
基因的拷贝数越多，蛋白质的表 达量越高。但过高的拷贝数可能 导致细胞死亡或蛋白质表达抑制 。
启动子强度
启动子是RNA聚合酶识别和结合 位点，启动子强度决定了蛋白质 的表达水平。选择合适的启动子 是蛋白质表达的关键。
蛋白质的表达纯化
目 录
• 蛋白质表达系统 • 蛋白质纯化方法 • 蛋白质的表达与纯化流程 • 蛋白质的表达与纯化的影响因素 • 蛋白质的表达与纯化的应用 • 蛋白质的表达与纯化的挑战与展望
01
蛋白质表达系统
原核表达系统
01
02
03
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌 表达系统能够高效表达外 源基因，产生大量的重组 蛋白质。
人胰岛素的酵母表达与纯化
人胰岛素的酵母表达与纯化1.项目意义作为治疗糖尿病的主要药物，胰岛素用于临床已有70多年，是临床上用量最大的蛋白质类药物，重组DNA技术出现，胰岛素是最表达的哺乳动物蛋白之一。
旨在改善现有商品。
胰岛素治疗学性能的研究，是胰岛素是胰岛素蛋白工程的主要内容。
现已知现已知各种胰岛素类物愈300多种，但具有临床前景的不多。
在天然突变胰岛素原有的基础上曾用化合方法合成人工人胰岛素，发现其活力高于天然胰岛素。
这也是通过改变氨基酸残基获得的高活力胰岛素，但有关重组胰岛素对其对其性质研究不够系统。
可以先利用猪腰素前体在酵母中分泌表达，表达产物的分离纯化，进而由纯化的表达产物通过酶促转酞获得人胰岛素以及人胰岛素的酵母蛋白。
2.相关研究进展酵母菌与人类的关系源远流长，早在八千年，人们就用酵母菌来制作面包、酿造葡萄酒、啤酒和清酒等。
到20世纪末酵母菌以作为一种模式生物在生物化学、遗传学和分子生物学研究等方面担任了重要的角色。
自从1978年建立酵母菌遗传转化技术以来，酵母菌已成为生产异源蛋白及其生物学分析方面最有用的真核微生物。
酵母菌的生物学研究取得了巨大的进展，1996年完成了酵母菌全基因组的序列测定，已建立了相关基因库，如啤酒酵母基因库，酵母蛋白组数据库，这些数据库容纳了有关酵母菌的6000多个基因及其蛋白质功能、结构和相互间的关系等大量信息。
现在已有不少用于食品和酿造工业的遗传修饰酵母工程菌问世。
早期关于胰岛素的研究是从猪、牛、羊的胰腺中提取的相关产品，直到1936年才利用重结晶法再锌离子的存在下得到了纯化的胰岛素结晶，而胰岛素纯化的真正历史性突破是1960年色谱技术出现以后，使纯度的单一胰岛素分子制成为可能。
1965年我国科学家首次完成了牛结晶的合成胰岛素，20世纪70年代丹麦首次产出半合成胰岛素。
1982年美国首先利用重组DNA技术合成了人胰岛素，标志着生物工程胰岛素产品时代开始。
1996年美国通过胰岛素化学结构进行了改造和修饰有开发出了第一个胰岛素类似物。
原核基因表达及其调控概要
质粒pKN402的复制起始位点是耐温型的，在42C时仍然 有很强的复制起始的功能。
电泳后回收片段c
电泳后回收片段1和3 连接
温度对3种表达载体质粒拷贝数的影响
由于pKN402和pCP3的复制子在42C时仍然具有很强的起 始复制能力，因此当培养温度升高到42C时，细胞中的 pKN402和pCP3的拷贝数要比pPLc2833高5～10倍。
Ptac 启动子：
是来自于lac和trp的一组杂合启动子，但是比lac和trp都强 得多，是一组强启动子。包括：
（1） PtacI：PlacUV5的-10区 ＋ Ptrp的-35区； （2） PtacII：Ptrp的-35区（一段合成的包括Pribnow框在
内的46bp的DNA） ＋ Plac的操纵基因； （3） Ptac12：Plac的-10区 ＋Ptrp的-35区
trp promoter色氨酸启动子 由色氨酸阻遏蛋白进行调控：正调控作用。可 形成启动子-阻遏蛋白复合物。
trp 启动子的脱阻遏可通过：
（1）移除色氨酸； （2）加入色氨酸结构类似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid）. 3’--吲哚丙烯酸
trpR 阻遏蛋白 Trp
色氨酸操纵子（trp operon）
第二章 原核微生物的基因表达与操作
2.1 原核微生物的基因表达及其调控 2.2 原核微生物的基因表达产物的分离纯 化
第一节 原核生物的基因表达与调控因素
（1）转录因素； （2）翻译因素； （3）蛋白质的稳定性； （4）胞外分泌的特性
一、原核生物的基因表达
（一）、转录对基因表达的影响
新生RNA序列与模板链 互补；与编码链相同。
（1）为pBR322衍生质粒，插入 了强启动子PlacUV5并在其下 游加入了-半乳糖苷酶的 编码序列（ -gal）21 bp 片断和一个EcoRI位点；
重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化
重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化一、本文概述本文旨在探讨重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达及其后续的分离纯化过程。
胰岛素作为一种关键的激素，在调节血糖水平中发挥着至关重要的作用。
然而，天然胰岛素的来源有限，且提取成本高昂，因此，通过基因工程技术在大肠杆菌中生产重组人胰岛素成为了一种可行且经济的替代方案。
本文首先介绍了重组人胰岛素的基因克隆和在大肠杆菌中的表达策略，然后详细阐述了胰岛素的分离纯化过程，包括细胞的破碎、蛋白质的提取、层析分离以及胰岛素的纯化等步骤。
本文还讨论了影响胰岛素表达及纯化的关键因素，并提出了优化表达及纯化条件的策略，以期提高重组人胰岛素的产量和纯度，为糖尿病治疗提供更为可靠和经济的药物来源。
二、重组人胰岛素的基因克隆与表达重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达首先依赖于对胰岛素基因的克隆。
基因克隆是生物技术中一项重要的技术，它涉及到从基因组DNA或cDNA中分离出特定的基因，然后将其插入到适当的载体中，以便在大肠杆菌等宿主细胞中进行复制和表达。
目的基因的获取：需要从人源的cDNA文库或基因组DNA中扩增出胰岛素的编码序列。
这通常通过PCR技术实现，需要设计一对特定的引物，它们能够与人胰岛素基因的两端互补结合。
载体的选择：为了在大肠杆菌中表达人胰岛素，需要选择一个合适的表达载体。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
这些载体通常含有启动子、终止子、复制原点和选择标记等元件，以确保目的基因在宿主细胞中的高效表达。
基因的克隆：将目的基因与载体连接后，通过转化技术将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中。
在适当的选择压力下，例如抗生素抗性，只有成功导入重组质粒的细胞才能生长，从而实现了对胰岛素基因的克隆。
表达条件的优化：在大肠杆菌中表达人胰岛素时，需要优化表达条件以获得最高的表达量。
这包括选择合适的培养基、调整培养温度、pH值以及诱导剂的浓度等。
表达产物的分析：通过SDS-PAGE、Western Blot等技术，可以对表达产物进行定性和定量分析，以确认胰岛素基因在大肠杆菌中的成功表达。
Ni柱纯化
一、为检测表达产物在E.coli BL21(DE3)胞质中是以可溶性物质还是以包涵体形式存在，我们采用下面的方法：（1）收集菌液，10，000×g，4℃，离心5min；1×PBS漂洗后离心收集沉淀。
（2）加入1×PBS，pH8.0（含有2%Triton X-100），振荡混匀后加入溶菌酶，在4℃反应30min。
（3）菌体用超声破碎仪作用10min，随后在10，000×g，离心10min。
（4）上清（胞质中的可溶性物质）和沉淀（包涵体沉淀）分别进行SDS-PAGE 电泳分析。
二、如果表达产物带有His标签，并且以不可溶性的包涵体形式存在于细胞中，所以我们采用Ni-NTA，在变性条件下进行分离纯化，具体过程如下：（1）3 ml菌体超声破碎后，收集包涵体沉淀。
加入200µl Buffer B，0.5μl β–巯基乙醇和4μl咪唑（终浓度为20mM）。
轻微混匀后，在室温放置1h，使包涵体充分溶解。
（2）12，000×g，离心10min，上清置于新的离心管中备用。
（3）取50μl 混合50%酒精的Ni-NTA，轻微离心后，吸去上清，Ni-NTA用等量的Buffer B洗涤两次。
（4）把包涵体破碎后的上清，加入到Ni-NTA中，室温轻微混匀30min。
（5）12，000×g，离心10sec沉淀Ni-NTA，去上清。
（6）在Ni-NTA中加入250μl Buffer C，和5μl咪唑（终浓度为20mM），轻微混匀后，12，000×g，离心10sec，去上清。
重复一次。
（7）加入25μl Buffer E，和5μl咪唑（终浓度为160mM），12，000×g，离心10sec，上清为含重组蛋白的洗脱液E。
重复三次。
（8）SDS-PAGE分析鉴定表达产物的分离纯化情况。
三、如果表达产物带His标签，并且都以可溶性的形式存在于细胞质中，所以我们采用Ni-NTA，在非变性条件下进行分离纯化。
生物技术制药试题(打印版)
生物技术制药试题1. 生物技术制药:生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。
2. 基因表达:基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。
3. 质粒的分裂不稳定:通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。
在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。
一般情况下具有质粒的细胞(即P＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。
4. 补料分批培养:发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。
它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。
因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。
5. 人-鼠嵌合抗体:嵌合抗体（ chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。
它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。
因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。
6. 悬浮培养:非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法
重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法重组门冬酰胺酶ⅱ的表达纯化与分析[导言]左旋门冬酰胺酶(lasparaginase,lsp)是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要的药物,应用日趋广泛。
然而,lsp可产生多种毒副作用,包括急性胰腺炎、药物性糖尿病、过敏反应、凝血功能障碍、肝功能损害等,在一定程度上限制了lsp的临床应用,尤其对于曾出现上述不良反应的患儿的后续治疗还能不能再用lsp,就成为一个急需解决的问题。
目前国内所有化学治疗中应用的ecii主要是依赖进口,完成表达ecii的基因工程菌株构建,并逐步进行ecii的工业化生产,对于国内all的临床化疗有积极意义。
为此,我们克隆了ecii的基因,在大肠杆菌中获得了高效表达,并探讨了其突变复性及后续纯化的简便方法。
国内亦开展了类似的工作。
[目的要求]1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。
2.掌握工程菌发酵培养、酶蛋白重组天冬酰胺酶II分泌表达、表达酶蛋白制备、酶活性测定、SDS-PAGE电泳鉴定的工作原理和技术方法。
【实验原理】利用微生物，尤其是大肠杆菌生产L-天冬酰胺酶的研究已经非常广泛和深入。
大肠杆菌可产生两种天冬酰胺酶，即L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，分别由其染色体上的基因ansa和ansB编码。
只有L-天冬酰胺酶II具有抗肿瘤活性。
L-天冬酰胺酶II在美国、德国和日本销售。
中国天津生化厂于1974年投入运行，随后因菌株降解和产量下降而停产。
目前，国内药品都是进口的。
1995年，我院构建了一株高效分泌和表达L-天冬酰胺酶II的基因工程菌株。
在大肠杆菌细胞中合成重组L-天冬酰胺酶II（RL ASP II）并分泌到周质中。
表达的RL-ASP的相对分子量ⅱ 其最大紫外吸收值为278nm。
本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rl-aspⅱ，再用硫酸铵分级沉淀、deae-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rl-aspⅱ。
表达产物的分离纯化
01
通过改变pH，可使吸附在离子交换剂上的蛋白质失去电荷而解离下来。
02
不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键的数目不同，即结合力大小不同，选择适当的洗脱条件（如改变离子强度），可将混合物中的成分逐个洗脱下来。
离子交换剂的分类
带正电荷，结合带负电荷的蛋白质
强碱型 弱碱型
01
分级分离
02
一般选排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。样品中各组份均能不同程度地深入凝胶内部，由于深入凝胶空隙程度的差异，得以分离。
03
4、凝胶层析的基本操作
注意凝胶的断层和气泡。
层析柱平衡：
操作压控制：
恒定的操作压是恒流的先决条件。
平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速；
平衡和洗脱时应维持流速恒定；
阳离子型：
阴离子型：
4）离子交换琼脂糖
CM-Sepharose
是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B，具有硬度大、性质稳定、流速好、分离能力强等优点，受pH和离子强度影响引起的膨胀和收缩效应小，外形和体积稳定。
DEAE-Sepharose
阴离子型：
阳离子型：
离子交换介质的选择原则
种类有Sephadex G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50表示1g干凝胶吸水量为5ml。
1）葡聚糖凝胶
2、凝胶介质的基本性质
Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤。
亲和层析的基本概念
亲和层析的基本特点 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间的特异性亲和力，进行分离的一类特殊的层析技术。
生物制药复习题（有答案）
生物制药复习题（有答案）《生物技术制药》习题（课后作业）一、下列概念：⑴生物制药：⑵生物药物：包括生物技术药物，天然生化药物，微生物药物，海洋药物和生物制品。
(3)生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。
(4)生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
（5）现代生物技术：以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。
（6）基因表达：⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。
2、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程（7）质粒的分裂不稳定：基因工程菌分裂时产生一定比例不含质粒的子代菌的现象,即重组分子从受体细胞中逃逸。
（8）质粒的结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
重组DNA分子某一区域发生变异，导致表观生物学功能的丧失；（9）显微注射：显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。
经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。
（10）悬浮细胞：（11）补料分批培养：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。
（12）连续培养行下去的一种培养方法。
（13）接触抑制：细胞在生长分裂时达到相互接触而停止分裂的现象,称为接触性抑制（14）单克隆抗体：由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。
（15）多克隆抗体：一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。
这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。
dna产物纯化原理
dna产物纯化原理DNA是构成遗传信息的核心分子，其产物指的是在DNA的复制、转录及翻译等过程中，所产生的相关分子物质。
DNA产物纯化是科学研究中的一个重要过程，它可以通过分离纯化DNA产物，进一步研究其结构和功能，有利于探究遗传信息的传递和表达机制。
一、DNA产物的分离DNA产物的分离是指根据分子量、电荷、结构等物理化学性质，将DNA产物从其它无关物质中分离出来的过程。
分离的方法有多种，如离心、层析、电泳等。
其中，层析和电泳方法比较常用。
1.层析方法层析运用不同物质在某种条件下对DNA产物产生的拖拽作用，将原液中的大颗粒物质与小颗粒物质相分离。
常用的层析方法有：凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等。
其中，凝胶层析应用最为广泛。
凝胶层析是将样品通过各种大小不等且具有一定的孔隙度的凝胶，使分子依据大小分别渗入凝胶孔隙内，进而实现产物的分离净化。
凝胶的孔隙大小主要取决于凝胶中交联浓度和聚合物量，聚合物所形成的结晶体系具有三维网络结构，可以用来分离大分子和小分子。
2.电泳方法电泳利用DNA分子在电场中受力向对立端移动的特性进行分离。
在电场中，分子的移动速度与分子电荷量、大小及电场强度、环境温度等因素除息息相关。
电泳分离DNA产物的方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳、超声波电泳、矩阵电泳等。
其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳是应用最广泛的电泳方法。
在这一方法中，DNA样品以负电荷向电极移动，由于不同的DNA分子长度不同，因此可以利用不同长度DNA分子的迁移速率进行分离和纯化。
二、DNA产物的提纯DNA产物的提纯是指在检测和研究中，将不同来源、性质的DNA 混合物中的目标DNA纯化出来的过程。
提纯的方法有多种，如柱式吸附、盐析、氯仿萃取等。
其中，柱式吸附是提纯DNA产物最常用的方法之一。
1.柱式吸附柱式吸附是根据DNA产物与特定物质之间的亲和力，将杂质分离出来，从而纯化目标DNA产物的过程。
这种方法主要应用于小规模DNA 产物纯化，通常使用硅胶颗粒、离子交换介质等进行分离。
酵母发酵液中重组人生长激素的表达及分离纯化
生长激素的作用
2.在人体中的作用：其含量与人的性别 、年龄等有一定的关系。①在细胞和组 织方面,可促进部分细胞的代谢和相关 组织的生长；②在新陈代谢调方面,可 促进蛋白质合成、维持氮平衡、增强脂 肪氧化分解及提高营养物质转换率等; ③在人体免疫方面也起到积极的作用。
图3-1 r-hGH的分离纯化示意图
结果预测与讨论
SECTION
结果预测
图 4-1 在培养皿克隆预测图 图4-2 酵母阳性克隆的PCR鉴定预测图
结果预测
图4-4 离子层析电泳检测预测图
图4-3 双水相处理及电泳检测结果预测图
展望
r-hGH在临床中应用非常广泛,市 场需求量大,提高 r-hGH的产量 是急需解决的问题。 为了提高产物的纯度和回收 率,还需进一步优化工艺,进行 更大规模的发酵实验。
图1-1 生长激素结构图
生长激素的作用
1.hGH的信号通路：人体生长速度与 人体中hGH的含量并不完全平行,研 究发现，hGH与肝细胞膜上生长激 素受体(GHR)数量呈显著的正相关。 GHR为细胞造血因子的一员。hGH 通过GHR介导,使hGH信号转入细胞, 刺激产生胰岛素样生长因子(IGF),从 而促进组织细胞的生长和增殖。
电转化
1.80uL感受态酵母+6µL的线性化质粒于1.5mL的EP管中混匀,置于电转仪上,660V 100Ω电 击,立即加入1ml山梨醇混匀; 2.将EP管放入30 ℃中水浴30min结束转化。
目的蛋白表达及分离纯化
目的蛋白的表达
将完成转化的毕赤酵母用选择培养基进行筛选, 筛选出来的阳性克隆用10mlYPD培养基进行扩 大培养并进行甲醇诱导蛋白表达。
毕赤酵母感受态制备及电转化
分离纯化方法
分离纯化方法分离纯化方法是生物化学和生物工程领域中非常重要的一环，它涉及到从混合物中分离出目标物质并将其纯化的过程。
在生物制药、生物能源、食品工业等领域，分离纯化方法的选择直接影响到产品的质量和产量。
因此，科学家们不断努力探索新的分离纯化方法，以满足不同领域的需求。
一、离心法。
离心法是一种常用的分离纯化方法，它利用离心机对混合物进行高速离心，通过不同组分的密度差异来分离它们。
离心法适用于细胞、蛋白质、病毒等生物颗粒的分离纯化，操作简单、速度快、效果明显。
但是，离心法对设备要求较高，成本较大，且无法对分子量相近的物质进行有效分离。
二、层析法。
层析法是一种基于物质在固定相和流动相之间分配系数不同而进行分离的方法。
常见的层析法包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等。
层析法适用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化，具有分离效果好、适用范围广的优点。
然而，层析法操作复杂，耗时较长，且需要较多的试剂和设备支持。
三、电泳法。
电泳法是利用物质在电场中的迁移速度差异来进行分离的方法，常见的电泳法包括凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦等。
电泳法适用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化，具有分辨率高、操作简便的特点。
但是，电泳法对样品的要求较高，且不适用于大规模生产。
四、超滤法。
超滤法是利用滤膜对混合物进行筛选分离的方法，常见的超滤法包括微滤、纳滤、超滤等。
超滤法适用于蛋白质、多糖、细胞等生物颗粒的分离纯化，具有操作简单、设备易得的优点。
然而，超滤法对样品浓度和粘度有一定要求，且易受到膜的污染和堵塞。
五、结合技术。
在实际应用中，常常需要结合多种分离纯化方法来达到更好的效果。
比如，可以先利用离心法去除大颗粒杂质，再通过层析法进行进一步纯化。
结合技术可以充分发挥各种方法的优势，提高分离纯化的效率和纯度。
总结。
分离纯化方法的选择应根据具体的实验要求和目标物质的特性来确定，需要综合考虑分离效果、成本、操作难度等因素。
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
实验步骤一：材料准备1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒二：实验操作1.试剂准备：2.2. 获得目的基因①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
3. 构建重组表达载体①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
4. 获得含重组表达质粒的表达菌种①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。
5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。
②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。
生物制药 习题答案
第一章绪论一、生物技术药物分为哪些类型？1.应用重组DNA技术制造的多肽、蛋白质类2.基因药物3.来自动物、植物和微生物的天然生物药物4.合成与部分合成的生物药物二、生物技术药物的特性1.分子结构复杂2.具有种属特异性3.治疗针对性强，疗效高4.稳定性差5.基因稳定性6.免疫原性7.体内的半衰期短8.受体效应9.多效应和网络性效应10.检验的特殊性三、生物技术制药的特征是什么？1.高技术2.高投入3.长周期4.高风险5.高收益第二章基因工程制药一、基因工程技术生产药品的优点有哪些？1.利用基因工程技术可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障。
2.可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。
3.利用基因工程技术可以发现和挖掘更多的内源性生理活性物质。
4.利用基因工程和蛋白质工程对生理活性物质进行修饰和改造，提高药效价值。
5.利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
二、基因工程药物制造的主要程序有哪些？分离目的基因，目的基因与载体连接构建DNA重组体，将DNA 重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌发酵，目的基因表达产物的分离纯化，产品的检验三、利用基因工程生产蛋白质或多肽首先需要得到其基因，制备目的基因常用的方法有哪些？目的基因来源于原核细胞，可选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因。
目的基因来源于真核细胞，常用的方法有：1.反转录法：为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可以从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA, 以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录生成该蛋白质mRNA互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶Ⅰ作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。
2.反转录PCR：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA第一链（不需要合成cDNA第二链），再以cDNA第一链为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
基因工程重点
名词解释:1．基因工程：狭义的基因工程:是指将一种生物体（供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。
广义的基因工程：是指DNA重组技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）;下游技术:基因工程菌(细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程.2．DNA重组技术：除少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为DNA重组技术。
3．基因组文库:将某种生物基因组DNA经超声波或限制酶部分酶切处理后，与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部基因的克隆群体。
4．cDNA文库：将某种生物基因组转录的全部mRNA通过反转录合成cDNA,与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部表达基因的克隆群体.5．PCR（polymerase chain reaction):利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火—延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。
6．Southern印迹杂交:是将DNA分子从电泳凝胶转印到硝酸纤维素膜上,进行核酸杂交的一种实验方法.7．基因诊断:通过检测致病基因（包括内源基因与外源基因）的存在、量的多少,结构变化与否、表达水平是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化,以此作为疾病确诊的依据.8．基因治疗(gene therapy)：指将人的正常基因或有治疗作用的基因,通过一定方式导入人体细胞，以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物高技术。
9．转基因动物:是人类按自己的意愿，借助基因工程技术，将外源基因导入动物受精卵，有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成,使外源基因与动物基因组整合、在体内稳定表达并能稳定遗传给后代的动物.10．转基因技术:将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的可遗传修饰,这一技术称为转基因技术。
生物技术制药题库附加答案
1 .利用基因工程技术生产药物的优点？答：1大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
2. 基因工程药物制造的主要程序有哪些？基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验3逆转录法：逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。
⒈ mRNA的纯化⒉ cDNA第一链的合成⒊ cDNA第二链的合成⒋ cDNA的克隆⒌将重组体导入宿主细胞：⒍ cDNA文库的鉴定：抗性基因失活法、噬菌斑颜色改变法⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定：核酸探针杂交法、免疫反应鉴定法4．基因工程宿主菌应满足那些要求？答：1、容易获得较高浓度的细胞；2能利用廉价易得的原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，产物容易提取。
5. 表达载体须具备哪些条件？常用载体有哪些？答：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
2、具多个限制酶切点，但每种切口最好只有1个，以便与外源基因连接。
3、具有某些标记基因，便于进行筛选。
4、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号。
5、具有很强的启动子。
6、有很强的终止子。
常用载体有：1、细菌细胞的质粒。
2、λ噬菌体载体。
6 。
真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件⑴载体能够独立复制。
载体本身是一个复制子，具有复制起点。
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。
生物技术制药第二版课后思考题及答案（全）
生物技术制药第二版课后思考题及答案（全）1. 生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类：（1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。
（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物2．生物技术制药具有什么特征？（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性3.生物技术制药中有哪些应用？应用主要有：（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3）酶工程制药（4）发酵工程制药4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。
质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。
提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌2）选择合适的载体（3）选择压力（4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7） PH值8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH (4)温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法：（1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌9.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么?方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。