醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白

【实验目的】

掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。

【实验原理】

蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。

血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。

表1 人血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量

蛋白质名称等电点相对分子质量

白蛋白 4.88 69000

α1-球蛋白 5.06 200000

α2-球蛋白 5.06 300000

β-球蛋白 5.12 90000~150000

γ-球蛋白 6.85~7.50 156000~300000 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH 溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。

肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。

【实验器材及试剂】

器材：醋酸纤维薄膜，人血清或牛血清，烧杯，培养皿，镊子，载玻片，盖玻片，电吹风，电泳槽，直流稳压电泳仪，剪刀，手套，滤纸；

试剂：巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L）

染色液（可重复使用，使用后回收）

漂洗液（100ml每组）：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml，水50ml

透明液（20ml每组）：无水乙醇14ml+冰乙酸4ml，混匀

【操作方法】

1. 薄膜浸泡：将醋酸纤维薄膜在缓冲液中浸透（30min），取出后用滤纸吸去多余缓冲液。

2. 调整电泳槽水平，加电极液，搭建滤纸桥。

3. 点样：用盖玻片蘸取少许血清，然后将其与距离薄膜一端1.5~2㎝处接触。血清投入后移去载玻片，将薄膜平贴于已放在电泳槽上并已浸透缓冲液的电桥上，点样端为阴极。

4. 电泳：先平衡10min，后90V预电泳10min，再调电压110V，电泳50min~1h左右，结束。（点样带不要接触滤纸条）

5. 染色：电泳完毕，将薄膜浸于染色液中5~10min。

6. 漂洗：取出薄膜，用漂洗液漂至背景无色（约4~5次）。

7. 透明：将薄膜平贴于干净的玻璃器皿壁上，用配制好的透明液滴在薄膜上，薄膜逐渐透明，待其完全透明后，用吹风机将薄膜吹干，然后小心将透明条带揭下。

【实验结果】

电泳结果：

【注意事项】

1. 取出薄膜吸取上面多余的缓冲液溶液时，注意不要长时间放置于滤纸上，防止渗于薄膜内的缓冲液被洗出来，而导致电泳时蛋白质不能完全分开，影响最后结果。

2. 在往电解槽中加入电极液时要注意电极液高度不能超过红色划线，且电极槽液面要保持一致，同时要漫过电桥，否则无法形成回路，不能进行电泳。

3. 连接电泳仪线路时要注意正负极，用前检查电泳仪是否可用，在打开电源之前一定要把电压旋钮调至零，否则一打开电源，瞬间电压过高会烧坏仪器。

4. 在把薄膜放到电桥上时，要注意点样区不能接触到电桥上的滤纸，且点样区放在阴极端，还有，薄膜必须要拉直，中间部分不能与电泳槽接触。

5. 撕条带必须在完全干燥后，判断是否干燥的方法为用手触摸一下薄膜，要是感觉不粘手，则说明可以揭下，否则不能揭；在干燥时要注意也不能过度，过度则不易揭下。

【思考与讨论】

本次实验得到的电泳带从效果来看不是太好，主要的问题有以下几个：

1.有些电泳带参差不齐；

2.个别电泳带的两条带之间界限不明显；

分析可能导致实验失败或误差的原因有以下几点：

1.将薄膜表面吸干时吸的太干或吸的不完全。因为点样时应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免

缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜；

2.用镊子取薄膜并吸干、点样的过程中，薄膜可能受到了异物污染；

3.缓冲液选择浓度不合适。因为缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过

高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨；

4.电流强度控制的不好，因为电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应

引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散；

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的试验中，如果区带的分离效果不好，可能存在的影响因素？

1.电泳时间不足

2.薄膜在染色或漂洗时重叠紧密且时间很长

3.薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足

4.点样时薄膜上是否存在多余的水分

实验过程中哪些操作会影响到实验条带的完整性，应该如何改正？

1.点样没有点好，盖玻片要直直的压在薄膜上，否则血清不均匀，影响电泳条带形状；

2.血清不宜过多，若过多则条带过宽，分离不完全；

3.也不易过少，过少则条带分离不完全。