肠道菌群研究的主要方法

肠道菌群研究的主要方法

长期以来，为了研究肠道菌群的成员及其功能，科学家们建立和发展了众多技术

手段。经典的微生物学研究方法主要通过对细菌进行纯培养，然后在不同的培养条件下对细菌的生理活性进行研究。而随着分子生物学技术的飞速发展，在对环境中的复

杂微生物群落进行研究时，科学家们越来越多地运用不依赖于培养的方法，全面分析

各种微生物在环境中的活动和对环境的影响。

基于分离培养的方法

在肠道微生物学研究中，科学家们通常使用一定的选择性液体或固体培养基，对

粪便或肠道粘膜、肠道内容物等样本进行培养和富集，并对培养得到的细菌种类进行分析。根据肠道细菌的特性，对肠道菌进行培养通常需要在厌氧的条件下进行，严格

的厌氧和培养基的选择对于肠道菌的分离和生长非常重要。但是，局限于纯培养的方法具有很多不足之处。首先，体外培养体系难以模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件，因此绝大多数的肠道微生物都还不能通过纯培养的方法得到分离；其次，仅仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株进行准确的鉴定。因此，在研究肠道菌群结构和功能的研究中，研究者们通常结合分离培养方法和分子生物学方法，对感兴趣的细菌种类进行研究。

二．分子生态学研究方法

分子生态学方法通常以环境中各种微生物的基因组核酸（DNA 或RNA）为研究

对象。在以肠道菌群为对象的分子生态学研究中，研究者们最常使用核糖体小亚基

RNA 基因（细菌中的16S r RNA 基因）的全部或部分序列作为分子标签来代表物种，以基

因序列的多样性代表物种的多样性，从而对菌群的组成结构进行分析。细菌16S r RNA 基因具有广泛性、进化变异小、具备高保守区和高变区（V 区）等特点，同时序列还具有信息

量巨大且更新迅速的公开数据库，如Database Project（RDP）、SILVA 、Greengenes 等等，研究者们可以方便地将自己研究中的16S r RNA基因序列与数据库进行比对，确定细菌的分类地位。类似的，为了对肠道菌群中具有特定功能的类群进行检测，研究者们也建立了以功能基因片段为分子标签的分析方法。

常用的分子生态学分析方法分为两大类：基于DNA 指纹图谱的分析方法和基于DNA

测序技术的分析方法。除此之外，可用于实时定量的荧光定量PCR（Real time quantitative PCR）和荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）也是常用的分析手段。DNA

指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代表微生物群落中各物种的

DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的结构差异。最常用的DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）和末端片段长度多态性（Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP）等。

不同于指纹图谱技术，DNA 测序技术的目的在于通过直接获取序列核酸信息的方法，

对群落中各物种的进化地位作出判断。基于单克隆质粒、转化细胞构建和桑格（Sanger）双脱氧法测序的16S r RNA 基因克隆文库长期以来广泛用于研究群落中微生物组成的方法，已被多次应用于人体肠道菌群的多样性分析，并获得了在物种检测深度和物种鉴定水平上均远远优于DNA 指纹图谱技术的结果

肠道菌群与健康相关研究中的应用